Révéler la précision de vos comptages manuels de cellules

Avez-vous déjà répété votre comptage cellulaire pour obtenir finalement un résultat très différent la deuxième fois ? Quand cela se produit, vous restez paralysé, vous remettez en question vos données et êtes incapable de prendre des décisions sur votre culture cellulaire ou vos expériences futures.

Dans tous les domaines scientifiques, la « précision » (ou la répétabilité) peut valider ou invalider des expériences. Malheureusement, le comptage manuel des cellules est particulièrement sujet aux erreurs aléatoires et, par conséquent, offre une faible précision. Mais si vous doutez de la précision de vos résultats, ne paniquez pas : il y a beaucoup de choses que vous pouvez faire pour améliorer la répétabilité de vos comptages cellulaires.

Dans cet article de blog, nous aborderons les sujets suivants : 

Jeu de fléchettes avec des résultats à la fois exacts et précis (à gauche), uniquement précis (au milieu) et ni exacte ni précis (à droite).

Comment mesurons-nous la précision du comptage cellulaire ?

Si vous n’êtes pas sûr que vos comptages cellulaires sont à jour, vous pouvez vérifier leur précision en répétant les mesures et en calculant l’écart type (σ) et le coefficient de variation (CV) de vos résultats.

Vous pouvez calculer l’écart-type qui montre la dispersion de vos résultats autour de la moyenne avec la formule suivante1:

Formule de l’écart type
REMARQUE : x = le nombre total de cellules individuelles, x̅ = la moyenne de toutes les valeurs, n = la taille de la population de cellules.

Un faible écart-type indique que le nombre de cellules ne diffère pas beaucoup de la moyenne, c’est-à-dire que vos comptages cellulaires sont cohérents, ce qui indique une grande précision.

Après avoir déterminé l’écart type de vos résultats, vous pouvez également calculer le CV. Il s’agit du paramètre le plus couramment utilisé pour indiquer la précision d’un comptage cellulaire, et il est généralement exprimé en pourcentage. Vous pouvez calculer le CV avec la formule suivante :

Formule du CV

Les compteurs de cellules manuels rodés visent généralement un CV de 5 à 15 %. Si votre CV est beaucoup plus élevé, vous cherchez probablement à savoir comment améliorer vos procédures de comptage cellulaire et augmenter votre précision.

Un guide étape par étape pour valider votre comptage cellulaire

Si vous avez encore des doutes relatifs à votre comptage cellulaire ou si vous travaillez dans un environnement où les bonnes pratiques de fabrication (BPF) sont appliquées, vous devez valider vos procédures. La validation démontre l’exactitude, la précision et la robustesse de vos procédés et prouve que votre méthodologie répond à l’objectif visé. Cela implique généralement de mener une série d’expériences, y compris des études de linéarité visant à établir la précision sur une plage de concentrations.

Pour en savoir plus sur la validation de vos méthodes de comptage cellulaire, regardez notre webinaire ’Quelle est la précision de vos comptages cellulaires ? : Un guide pour la validation d’une méthode de comptage cellulaire’.

Quelles sont les quatre sources d’erreur majeures induites par le comptage manuel ?

Le comptage manuel à l’aide d’un hémocytomètre est souvent sujet à des erreurs. Les erreurs typiques peuvent atteindre 20 à 30 %2, et la faible précision est l’un des principaux inconvénients de l’hémocytomètre. Identifier les erreurs qui influencent vos résultats est la première étape vers l’augmentation de votre précision et vers la réduction de votre CV.

Nous décrivons ci-dessous quatre facteurs majeurs affectant la précision du comptage cellulaire :

1. L’erreur humaine lors de la préparation des échantillons

Comme toutes les procédures reposant sur une préparation manuelle, le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre est sujet à l’erreur humaine provenant de diverses sources, notamment d’un pipetage imprécis, des erreurs de dilution et d’une solution mal mélangée.3

Des erreurs peuvent également découler d’une surcharge des chambres de l’hémocytomètre. Bien que l’hémocytomètre contienne un volume donné, l’espace entre la chambre de comptage et la lamelle en verre peut être légèrement plus important lorsque la chambre est remplie de liquide. Une surcharge de la chambre de comptage entraîne une sous-estimation du volume de l’échantillon et une surestimation de votre concentration cellulaire.

Illustration montrant les composants d’un hémocytomètre. A gauche, l’hémocytomètre n’est pas trop rempli, contrairement à celui de droite.

2. La subjectivité dans le processus de comptage

La différenciation entre cellules et débris ou autres particules peut être délicate, même pour un œil expert. Si vous n’arrivez pas à faire facilement la distinction entre les cellules et les débris, votre nombre de cellules pourrait s’avérer artificiellement élevé.

Il peut également être difficile d’établir si une cellule se trouve à l’intérieur ou à l’extérieur d’une grille de comptage. Par conséquent, le comptage manuel des cellules peut être subjectif et le résultat final peut dépendre de l’opérateur. Une publication récente de Manzini et al. a montré que, même lorsque les opérateurs sont très expérimentés en matière de comptage cellulaire, la variation inter-opérateurs peut atteindre quasiment 20 %.4

3. Incohérences dans la coloration cellulaire

Le bleu de trypan est l’un des colorants les plus utilisés dans le comptage manuel des cellules. C’est un colorant imperméable à la membrane qui ne colore que les cellules non-viables dont les membranes cellulaires sont endommagées. Cependant, le bleu de trypan ne colore pas les cellules de manière uniforme. Cela provoque des incohérences dans les comptages cellulaires puisqu’il peut être difficile de différencier les cellules non-viables légèrement colorées des cellules viables.

Le bleu de trypan est également toxique pour les cellules, par conséquent le nombre de cellules mortes peut être plus élevé si vous laissez passer plus de temps entre la coloration et le comptage. De plus, comme le bleu de trypan est un sel, il peut interférer avec l’osmorégulation, ce qui peut faire éclater les cellules, abaisser artificiellement le nombre total de cellules mortes et conduire à une surestimation de la viabilité de la culture cellulaire.

Ce webinaire vous en dit plus sur la façon dont le bleu de trypan peut affecter les cellules.

4. Erreurs de calcul

Le comptage manuel des cellules repose sur plusieurs calculs, notamment le facteur de dilution, le nombre total de cellules ou la concentration, la viabilité, l’écart type et le CV. Comme pour tous les calculs, il existe un risque d’erreur humaine lors de la saisie de données ou de l’exécution des calculs. Les erreurs significatives sont généralement faciles à identifier mais des erreurs négligeables (savoir si le dernier chiffre est 1 ou 7, par ex.) peuvent passer inaperçues et avoir quand même un impact sur la précision de vos résultats finaux.

Comment augmenter la précision du comptage cellulaire

Une fois que vous identifiez la source de vos erreurs, vous pouvez commencer à les réduire ou à les éliminer pour augmenter votre précision globale.

Travailler avec soin et cohérence peut réduire les effets de l’erreur humaine. Lors du remplissage de l’hémocytomètre, faites très attentions à ne pas trop remplir la chambre.

L’impact de la subjectivité dans le processus de comptage peut être réduit en augmentant le nombre de chambres que vous comptez et en effectuant des comptages cellulaires en double ou en triple pour valider vos résultats. Si vous décidez d’effectuer des mesures répétées, assurez-vous de prendre un nouvel aliquot de cellules, de le mélanger au colorant choisi et de recharger la chambre, plutôt que de vous limiter à recompter les cellules ou à recharger votre chambre avec un deuxième échantillon qui est déjà coloré. Cela vous donnera la mesure répétée la plus représentative.

Plus le nombre de cellules comptées est élevé, plus les effets des erreurs aléatoires sont faibles et plus les résultats seront précis. En règle générale, vous devez compter au moins 400 cellules par échantillon (pour plus d’informations, consultez notre note technique ‘Effets de la concentration de l’échantillon sur la variation du comptage cellulaire’).

Vous pouvez réduire la variation entre les utilisateurs en convenant de règles de comptage cellulaire et en les appliquant de manière cohérente. Pour plus d’informations sur les règles et procédures de comptage cellulaire, voir ‘Nous divulguons nos secrets : Comment effectuer le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre.’

Vous pouvez réduire le risque d’erreurs en automatisant vos calculs. Par exemple, vous pouvez utiliser notre feuille de calcul de comptage cellulaire téléchargeable qui détermine votre facteur de dilution, le nombre total de cellules, leur viabilité, l’écart type et le CV. À l’aide de cette feuille de calcul, vous pouvez éliminer les erreurs et ainsi vous n’aurez plus à vous soucier de savoir si vous appuyez sur la touche « 5 » ou « 6 » de votre calculatrice.

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Passer au comptage cellulaire automatisé

Si vous rencontrez des problèmes de précision dans le cadre de vos comptages cellulaires, envisagez d’utiliser un compteur automatisé. Les processus automatisés éliminent les erreurs en appliquant, de manière cohérente et à chaque fois, des protocoles de comptage. De plus, ils comptent rapidement un grand nombre de cellules, en minimisant ainsi les effets des erreurs aléatoires. Certains compteurs automatisés utilisent également des colorants fluorescents au lieu du bleu de trypan, éliminant ainsi les problèmes associés à une coloration et à une toxicité incohérentes.

Les graphiques ci-dessous montrent la précision du comptage manuel par rapport au comptage automatisé à des concentrations différentes. Les graphiques A et B montrent le CV en fonction de la concentration cellulaire pour A) le comptage cellulaire automatisé avec NucleoCounter® NC-202™ et B) le comptage cellulaire manuel à l’aide d’un hémocytomètre.5

Dans le graphique A, la plupart des points de données sont situés sur ou à proximité de la courbe ajustée (la moyenne) : cela indique une faible variance et une grande précision. Dans le graphique B, les points de données sont dispersés et seuls quelques-uns sont situés sur la courbe ajustée : cela indique une faible précision. Il est vrai que les méthodes de comptage cellulaire automatisées et manuelles montrent une augmentation du CV à des concentrations cellulaires plus faibles à cause de l’augmentation des erreurs aléatoires, cependant, cette augmentation est plus faible avec un compteur automatisé.

Nuages de points montrant le CV lors du comptage cellulaire à l’aide du NucleoCounter® NC-202™
Nuage de points montrant le CV lors du comptage manuel de cellules

La comparaison des deux graphiques montre que le comptage cellulaire automatisé offre une meilleure précision que le comptage manuel. En fait, l’utilisation d’un compteur automatisé peut doubler votre précision par rapport à l’utilisation d’un hémocytomètre et à un comptage manuel.5

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Références

  1. Ross, S. M. (2014). Introduction to Probability and Statistics for Engineers and Scientists (Fifth Edition), Chapter 2. Academic Press.
  2. Electron Microscopy Sciences: Neubauer Haemocytometry.
  3. Biggs, R. et al. (1948). The Errors of Some Haematological Methods as They Are Used in a Routine Laboratory. Journal of Clinical Pathology, 1(5):269-287.
  4. Manzini, P. et al. (2022). Validation of an automated cell counting method for cGMP manufacturing of human induced pluripotent stem cells. Biotechnology Reports, 33:e00708.
  5. ChemoMetec: Note Technique: NucleoCounter® NC-202™ Performance Data.

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