Réponses à toutes vos questions sur le comptage cellulaire
Et quatre variables importantes à considérer
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Le comptage cellulaire peut donner un excellent aperçu de l’état de votre culture cellulaire. Ici, nous répondons à toutes vos questions brûlantes à ce sujet, alors préparez-vous !
Points clés :
- Quantifier des cellules vous aide à déterminer leur viabilité et leur cycle de croissance
- Les méthodes manuelles se basent sur l’utilisation d’un hémocytomètre et sont observés par microscopie optique
- Les instruments automatisés se basent soit sur l’impédance électrique, soit sur la cytométrie en flux, soit sur la cytométrie d’image
- La durée, la précision et la cohérence varient selon l’approche choisie
Qu’est-ce que le comptage cellulaire ?
Une question simple mais importante. Certains pourraient dire que le comptage cellulaire consiste simplement à compter des cellules. Mais en réalité, c’est bien plus que cela. Le comptage cellulaire, est, entre autres,
- une routine. Maintenez la cohérence dans vos expériences avec des cellules en les surveillant. S’assurer qu’elles paraissent et agissent comme prévu vous permet de prendre les devants.
- un examen approfondi. Cela vous apprend beaucoup sur la viabilité des cellules ainsi que sur l’écart type et la variance si vous effectuez plusieurs fois le comptage cellulaire. Bien sûr, d’autres facteurs que l’état des cellules ont un impact sur ces données mais nous en reparlerons plus tard.
- prendre soin. Prendre soin de ses cellules et de leur santé. Gardez un œil sur leurs performances dans leur milieu de culture et créez les meilleures conditions pour qu’elles se développent.
- une préparation. Planifiez et maintenez une culture cellulaire jusqu’à ce que ce soit nécessaire. Il est crucial de le faire dans différents tests ou dans la production de protéines, par exemple, pour obtenir les résultats souhaités.
Quelles sont les méthodes ?
La principale distinction en matière de comptage cellulaire se fait entre techniques manuelles et automatisées. Les deux méthodes de comptage cellulaire nécessitent une coloration des cellules avant le comptage afin de différencier les cellules mortes des cellules viables d’un échantillon.
Dans le comptage manuel des cellules, le bleu de trypan est souvent utilisé pour colorer les cellules mortes car il ne peut pas pénétrer dans la membrane des cellules vivantes1. D’autres colorants utilisés sont l’iodure de propidium (PI), l’érythrosine B, l’orange d’acridine (OA) et le DAPI.
Commençons par la méthode manuelle.
Comptage manuel des cellules
C’est une méthode que la plupart d’entre nous connaissent. Vous disposez d’une culture cellulaire diluée (par ex., dans du PBS) que vous colorez. Vous pouvez ensuite compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un compteur2. Pour une présentation plus approfondie, consultez notre blog sur les hémocytomètres.
Avantages : La plupart des équipements ne sont achetés qu’une fois. La seule pièce interchangeable est l’hémocytomètre (que vous pouvez éventuellement laver et réutiliser), ce qui rend ce moyen de comptage cellulaire extrêmement économique.
Pour remplir l’une des chambres de l’hémocytomètre, vous n’aurez besoin que de 10 μl de suspension cellulaire diluée pour réaliser un comptage même d’une culture cellulaire de faible volume.
Désavantages : Cette méthode est soumise à une grande subjectivité pour savoir ce qui peut être considéré comme une cellule et cela peut affecter la précision du nombre total de cellules. C’est un problème particulièrement évident lorsque vous travaillez avec des cellules agrégées.
De plus, vous aurez besoin d’expérience dans la manipulation d’un microscope pour compter les cellules . Le comptage manuel des cellules prend en effet un temps relativement long, ce qui entraîne également des coûts de main-d’œuvre plus élevés.
N’oublions pas les méthodes automatisées.
Les compteurs automatisés de cellules se subdivisent en trois catégories. Cela pourrait paraître un peu intimidant mais n’ayez pas peur, nous vous guiderons dans cette découverte.
Basés sur l’impédance électrique
Les compteurs de cellules basés sur l’impédance électrique sont appelés aussi compteurs Coulter. Ils se basent sur le principe Coulter selon lequel l’impédance d’une particule dans un courant électrique diffère de celle de son tampon ou milieu. Les cellules sont comptées en les pompant à travers une ouverture et en mesurant la résistance3.
Avantages : Les compteurs Coulter peuvent compter de nombreux types de particules, y compris des cellules nucléées et non-nucléées. Ils vous permettent aussi d’obtenir un nombre précis de cellules dans chaque volume par opposition à la méthode manuelle. En effet, dans cette dernière, les cellules/μl sont estimées en fonction du nombre de cellules dans une petite partie.
Désavantages : Cette méthode ne vous permet pas de différencier les cellules viables des non-viables, à la différence des méthodes basées sur l’image. D’autres limitations résident dans le fait que les petites particules peuvent passer inaperçues, les agrégats sont comptés comme une cellule et votre choix de milieu cellulaire est limité aux électrolytes.
Méthodes basées sur la cytométrie optique/en flux
La cytométrie en flux permet également de compter et caractériser les cellules. Dans ce type de compteur, un laser d’excitation est dirigé vers les cellules, faisant passer la lumière diffusée à travers divers filtres et détecteurs. Ces signaux sont ensuite amplifiés et transmis à un système informatique pour qu’ils soient analysés3.
Avantages : C’est une méthode qui permet de gagner du temps et de réaliser un comptage cellulaire rapide et précis, impossible avec le comptage manuel. Grâce à cette méthode, vous pouvez déterminer la viabilité cellulaire avec un colorant fluorescent perméable à la membrane et un autre imperméable. La longueur d’onde d’excitation des cellules viables différera de celle des cellules non-viables et reflétera ainsi la viabilité cellulaire.
Désavantages : L’outil essentiel ici est un cytomètre en flux, un instrument onéreux par rapport aux compteurs cellulaires basés sur l’image (voir la section ci-dessous). En outre, vous aurez besoin d’une formation avant d’utiliser un cytomètre en flux pour compter les cellules. En effet, il pourrait s’avérer difficile de quantifier les cellules qui ont tendance à s’agréger.
Cytométrie basée sur l’image
La cytométrie basée sur l’image dépend fortement du traitement d’images de cellules au moyen de l’apprentissage automatique et des algorithmes avancés adaptés au protocole de comptage cellulaire spécifique.
Ces images sont prises à travers l’objectif d’un microscope soit en champ clair soit à fluorescence3.
Avantages : La reconnaissance informatisée des cellules par cette méthode permet de quantifier les agrégats.
Elle garantit également la cohérence du protocole de comptage cellulaire car il s’agit d’un microscope qui s’interface avec un ordinateur, ce qui permet d’éliminer les biais humains.
Désavantages : Un cytomètre basé sur l’image est un instrument onéreux par rapport à un hémocytomètre. Beaucoup de ces compteurs cellulaires nécessitent également l’utilisation de lames ou de cassettes spéciales à usage unique pour charger l’échantillon.
Quatre variables importantes à considérer
Avant d’opter pour le comptage manuel ou automatisé des cellules, voici quelques facteurs à prendre en compte :
#1 Le prix a son importance !
Tout le monde convient que le comptage manuel des cellules est nettement moins cher en raison du faible coût de l’hémocytomètre par rapport à celui des instruments automatisés. Cependant, vous devez considérer qu’il y a des frais supplémentaires, ceux du travail humain (ce qui représente BEAUCOUP, en réalité).
Le comptage manuel est également sujet à de nombreuses erreurs2, et comme nous le savons tous, les erreurs coûtent cher. Ces dépenses sont supprimées par l’utilisation d’un compteur automatisé.
#2 La cohérence est la clé de tout
Chaque scientifique sait que pour que ses résultats expérimentaux soient valides, un chercheur d’un autre laboratoire doit être en mesure d’appliquer le même protocole et d’obtenir les mêmes résultats.
Cette reproductibilité est assurée par les compteurs automatisés de cellules en raison de leur degré élevé de standardisation. En revanche, dans le comptage manuel des cellules, d’autres facteurs interfèrent avec les résultats. Dans la section #3, vous trouverez plus d’explications à ce sujet.
#3 L’œil humain est-il suffisamment précis ?
Vous avez sûrement essayé d’effectuer deux fois le même comptage cellulaire pour constater que le nombre de cellules varie de l’un à l’autre pour le même échantillon !
Ce problème est particulièrement rencontré lors du comptage manuel des cellules, en partie à cause du biais humain (qui décide ce qui est une cellule) et en partie parce qu’un hémocytomètre est vite trop rempli. Vous pouvez éviter ces obstacles en optant pour des compteurs de cellules automatisés qui éliminent les erreurs humaines. En savoir plus.
#4 Accélération du processus
Au départ, le comptage automatisé de cellules peut prendre du temps car son utilisation requiert une formation, mais une fois que vous l’aurez maîtrisé, vous serez plus rapide qu’avec la méthode manuelle.
Le comptage manuel de cellules est chronophage car les cellules sont comptées une par une et des calculs tels que le comptage du nombre total de cellules et leur viabilité sont ensuite effectués manuellement. Grâce à la méthode automatisée, tout ce travail est confié au compteur cellulaire, ce qui vous fera gagner du temps pour tous les autres projets passionnants de votre laboratoire !
Domaines où le comptage cellulaire est réalisé
Maintenant que vous savez (presque) tout sur le comptage cellulaire, nous aimerions vous expliquer pour quelles applications vous pouvez l’utiliser.
- Thérapie cellulaire : Le comptage cellulaire est utilisé pour déterminer les doses pour les thérapies cellulaires mais c’est également un outil qui permet de s’assurer que le produit est standardisé4.
- Bioprocessing : Dans ce domaine, le comptage cellulaire est utilisé pour surveiller de manière routinière l’état, c’est-à-dire la croissance et la viabilité des cultures cellulaires dans les bioréacteurs. Cela permet d’optimiser le rendement basé sur la phase de croissance de la culture cellulaire5.
- Développement de médicaments : Une fois que les cellules ont été traitées avec des candidats médicaments potentiels, le comptage cellulaire sert à surveiller la viabilité. Il est également crucial afin d’assurer la reproductibilité6.
Donc, comme vous pouvez le voir, les limites sont infinies. Qu’il soit manuel ou automatisé, le comptage cellulaire a de nombreuses applications qui compléteront sûrement votre travail de laboratoire et vous aideront à obtenir de meilleurs résultats.
Alors, qu’attendez-vous ? Essayez certaines de ces différentes méthodes et découvrez celle qui convient le mieux à votre laboratoire. Bon comptage !
Lectures complémentaires
- Journal: Dévoiler les secrets : Comment compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre
- Journal: Numération de cellules automatisée vs numération manuelle
- Webinaire: Les cellules collantes faussent-elles vos données ?
- Journal: Le bleu de trypan est-il toxique ? Les dangers cachés d’un colorant très utilisé
- Webinaire: Le PBS affecte-t-il vos cellules ?
- La gamme NucleoCounter®: Compteurs et analyseurs cellulaires automatisés
Références
- Johnson, S., Nguyen, V. and Coder, D. (2013), Assessment of Cell Viability. Current Protocols in Cytometry, 64: 9.2.1-9.2.26
- Electron Microscopy Sciences: Neubauer Haemocytometry
- Vembadi A, Menachery A, Qasaimeh MA. Cell Cytometry: Review and Perspective on Biotechnological Advances. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:147
- Sarkar S, Pierce L, Lin-Gibson S, Lund S (2019). Standards Landscape in Cell Counting: Implications for Cell & Gene Therapy. Cell and Gene Therapy Insights. 5. 117-131. 10.18609/cgti.2019.016.
- Butler M, Spearman M, Braasch K (2014). Monitoring Cell Growth, Viability, and Apoptosis. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 1104. 169-92. 10.1007/978-1-62703-733-4_12.
- Niepel M, Hafner M, Mills CE et al. A Multi-center Study on the Reproducibility of Drug-Response Assays in Mammalian Cell Lines. Cell Syst. 2019 Jul 24;9(1):35-48.e5
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