Protocole de phénotypage cellulaire pour caractériser les maladies héréditaires en cytométrie par imageur
-Caractérisation facile et rapide des paramètres cellulaires
Le déficit en acyl-CoA des acides gras à très longue chaîne (VLCADD) comme modèle pour déveloper un nouveau protocole de phénotypage cellulaire
Afin de développer un modèle innovant de phénotypage cellulaire, les auteurs ont utilisé des fibroblastes dermiques humains (HDF). La lignée cellulaire NHDF a été utilisée comme témoin et pour les comparer aux HDF provenant de malades atteints de déficit en acyl-CoA des acides gras à très longue chaîne (VLCADD). Une déficience du gène VLCAD empêche la β-oxydation des acides gras causant une augmentation du niveau des radicaux libres (ROS) et des dysfonctionnements mitochondriaux. Les patients atteints de VLCADD peuvent présenter plusieurs symptômes en fonction de la gravité de la maladie.
1 échantillon – 3 paramètres analysés avec des tests clé-en-main
Les auteurs ont décidé d’utiliser le NC-3000™ pour étudier les fibroblastes dermiques humains en fonction de 3 paramètres :
1) La concentration cellulaire et la viabilité – comme indicateurs de la mort cellulaire et de la prolifération.
Le test est réalisé en 2 étapes. D’abord, afin de déterminer la concentration cellulaire totale, les membranes plasmiques sont lysées et les noyaux intègres sont incubés avec du DAPI, un fluorophore incapable de traverser la membrane plasmique d’une cellule vivante qui devient fluorescent lorsqu’il est complexé à l’ADN. Ensuite, le nombre de cellules mortes est déterminée en ajoutant du DAPI directement sur l’échantillon non traité. Dans ces conditions, seules les cellules mortes sont marquées. La viabilité cellulaire est calculée selon la formule :
Viabilité% = ((nombre de cellules totales – nombre de cellules mortes) / nombre de cellule totales) * 100
2) Potentiel rédox des groups thiols (TRS) – le statut du potentiel redox des groupes thiols renseigne sur le potentiel rédox intracellulaire et donc leur degré d’avancement dans l’apoptose.
Déterminé à l’aide du composé VitaBright-48TM, un fluorophore capable de traverser la membrane plasmique qui devient fluorescent en réagissant avec les groupes thiols des protéines.
3) Le potentiel membranaire mitochondrial (MMP).
Le maintien du MMP est essentiel aux fonctions mitochondriales et il fournit donc des informations cruciales à propos de l’intégrité de cet organite. Ce MMP est déterminé à l’aide du JC-1, qui fluoresce en rouge lorsqu’il s’accumule à la surface des membranes mitochondriales intègres mais en vert lorsque cette membrane est altérée chez les cellules en apoptose.
Les tests clé-en-main pour évaluer tous ces marqueurs sont intégrés au NC-3000™. Comme la préparation initiale de ces étapes est la même pour tous les tests, un seul échantillon est nécessaire ce qui permet de gagner en efficacité.
Fig. 1 Schéma du protocole de phénotypage. Environ 1,6 millions de HDF sont ensemencés dans une plaque T75. Après 24h, les HDF sont traités avec 0, 2 et 4 mmol/L de péroxyde ‘hydrogène (H2O2) pendant, 1h, 1h30 ou 2h. Les HDF sont ensuite décollées à la trypsine et transférées dans un tube de 15 mL. Quatre aloquots sont prélevés pour un comptage cellulaire, une mesure de la viabilité, une mesure de la vitalité (ROS=potentiel redox intracellulaire) et une mesure du potentiel mitochondrial.
Validation du protocole de phénotypage
Afin de valider le protocole de phénotypage cellulaire, les HDF ont été traités à l’H2O2 et les 3 paramètres précédemment cités ont été évalués. Puisque le stress oxydatif ainsi généré est cytotoxique, le traitement à l’H2O2 a provoqué une baisse significative de la viabilité et donc de la concentration cellulaire (Fig 2A). Comme attendu, cette observation corrèle parfaitement avec la forte diminution des thiols réduits au niveau intracellulaire (ROS) mesuré au VitaBright-48TM (Fig 2B). Aussi, le traitement à l’H2O2 conduit également à une dépolarisation des membranes mitochondriales, révélant une perte de la fonction mitochondriale et un début d’apoptose chez les cellules traitées (Fig 2C). Aussi, les tests préchargés utilisés lors de ce protocole de phénotypage permettent d’identifier et mesurer à la fois les changements cellulaires et mitochondriaux déclenchés par l’apoptose.
Source: https://researchgate.net
Fig. 2 Effet de traitements à l’H2O2 sur 2 lignées de NHDF. Les cellules NHDF ont été traitées avec 0, 2 ou 4 mmol/L de péroxyde d’hydrogène pendant 1h, 1h30 ou 2 h. (a) Mesure de la viabilité. La viabilité cellulaire a été évalué au DAPI. (b) Quantification des thiols intracellulaires réduits (ROS). Les HDF ont été incubés avec du VitabBright-48 (VB-48), de l’acridine orange (AO) et de l’iodure de propidium (PI). Le VB-48 a été utilisé pour déterminer les niveaux intracellulaires de thiols libres, l’AO comme un marqueur cellulaire et le PI comme un marqueur des cellules mortes (exclues lors de cette analyse). Les valeurs affichées correspondent à l’intensité de fluorescence moyenne (MFI). (c) Potentiel de la membrane mitochondriale (MMP). Les HDF ont été incubées avec du JC-1 pour quantifier le pourcentage de cellules avec une membrane mitochondriale dépolarisée et les cellules mortes marquées au DAPI ont été exclues.
Phénotypage cellulaire des HDF de patients atteints de VLCADD
Les auteurs ont ensuite testé des cellules HDF provenant de patients avec une forme légère ou sévère de VLCADD. Ils ont pu montrer que des fortes concentrations de H2O2 provoquent une baisse de la viabilité dans les fibroblastes de patients atteints d’une forme légère ou sévère de la maladie. Ceci suggère que les cellules présentant la VLCAD sont plus sensibles au stress oxydatif. Pour autant, les fibroblastes malades ne présentent aucune différence avec les cellules saines en ce qui concerne le potentiel rédox intracellulaire mesuré au VitaBright-48TM assay alors que les fibroblastes issus de patients avec la forme légère de la maladie montrent une augmentation du nombre de cellules ayant leur membrane mitochondriale dépolarisée. Tous ces tests ont donc permis de caractériser et identifier les différentes réponses cellulaires en fonction du degré de la maladie.
La cytométrie par imageur pour développer des nouveaux protocoles de phénotypage cellulaire
Dans cet exemple, l’équipe de Fernandez et al a montré que la cytométrie par imageur peut être utilisée pour développer de nouveaux protocoles de phénotypage cellulaire pour l’étude de mécanismes moléculaires pathologiques chez des patients porteurs d’une anomalie génétique. En utilisant 3 tests clé-en-main du NC-3000, ils ont pu caractériser les changements phénotypiques des fibroblastes cultivées en mimant les conditions physiopathologiques. Aussi, ils ont identifié les différences entre les fibroblastes provenant d’individus sains ou de patients atteints de VLCADD.
Le NC-3000™ propose différents tests additionnels pour caractériser l’apoptose, le cyle cellulaire, ainsi qu’un module personnalisable appelé FlexiCyte, qui permet d’analyser jusqu’à 4 biomarqueurs fluorescents différents. Chacun de ces tests clé-en-main peut être intégré dans un protocole de phénotypage selon les besoins. Avec ces protocoles disponibles sur le NC-3000™, il suffit d’une seule préparation cellulaire, permettant ainsi de gagner du temps et d’utiliser un faible volume de l’échantillon pour diverses analyses.
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