Production clinique de cellules CAR-T pour l’immunothérapie adoptive
– avec les NucleoCounter®
Le NucleoCounter® offre une méthode robuste pour déterminer le nombre de cellules ainsi que leur viabilité lors de la production de lots cliniques de cellules CAR-T. Les propriétés uniques de la Via1-Cassette™ combinant prélèvement, marquage et remplissage de la chambre de mesure en une étape suivi de l’acquisition automatisée d’image en fluorescence qui sera analysée par le NucleoCounter® garantissent une mesure avec un précision inégalable.
La détection des cellules T, même en présence d’érythrocytes, de billes ou de réactifs de formulation repose sur l’acridine orange et le DAPI, qui sont déjà préchargés dans la Via1-cassette™. Ainsi, le NucleoCounter® est l’instrument idéal pour la production de cellules CAR-T.
Immunothérapies adoptives basées sur les cellules CAR-T
L’une des approches les plus prometteuses dans le domaine de la thérapie cellulaire est l’immunothérapie basée sur les cellules T. Ces cellules T patients-spécifiques peuvent être modifiées pour exprimer des récepteurs de cellules T ou des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) afin d’augmenter la réponse des cellules T envers différentes pathologies, telles que les rejets de greffes ou certains cancers. La thérapie cellulaire adoptive CAR-T consiste à prélever une partie des PBMC du patient, puis à enrichir une sous-population de cellules T qui sera génétiquement modifiée par transfection virale pour générer les cellules CAR-T. Ces dernières seront ensuite produites à grand échelle et réintroduites chez le patient. Avec le NucleoCounter® NC-200™, il est possible de vérifier chaque étape de ce procédé tout en maintenant les conditions GMP (Figure 1).
Suivi du process: de la leucaphérèse au produit final avec le NucleoCounter® NC-200™
Figure 1: Suivi de la procédure entière allant de la leucaphérèse jusqu’au produit final. Grâce au NucleoCounter® NC-200™, il est très facile de suivre toutes les étapes de la purification, de l’expansion et de la formulation des cellules avec un seul et même instrument pour assurer des mesures précises, fiables et reproductibles.
Les protocoles simples et adaptables permettent d’effectuer des comptages directement à partir des leucaphérèse ou des cellules CAR-T purifiées ou produites avec un seul et même instrument. La Via1-Cassette™ est préchargée avec les 2 marqueurs fluorescents pour éviter les variations importantes de comptage observées avec des imageurs en lumière visible. Lorsque les échantillons contiennent des hématies, un pré-traitement avec un tampon de lyse spécifique des érythrocytes va empêcher le quenching de l’hémoglobine. Cette analyse en fluorescence avec des marqueurs spécifiques du noyau (acridine orange et DAPI) permet d’exclure les débris, les micelles et les objets de petite taille (plaquettes) pour renvoyer des résultats précis. Et même si des billes magnétiques sont utilisées pour purifier les cellules T, elles n’ont aucune influence lors du comptage au NucleoCounter® NC-200™ puisqu’elles ne sont pas marquées par les colorants. Ainsi, le NucleoCounter® NC-200™ peut être utilisé tout au long du process de production.
Application note (.PDF):
Gestion et affichage des données
Figure 2: Gestion et affichage des données via le logiciel NucleoViewTM. NucleoView est un logiciel d’analyse d’image très simple d’utilisation permettant de générer automatiquement des diagrammes de dispersion à partir de l’image en fluorescence pour sélectionner spécifiquement les cellules tout en excluant les débris.
Le logiciel NucleoView™ permet d’effectuer une inspection visuelle de l’image en fluorescence pour vérifier le comptage (Figure 2). Les événements spécifiques de la population peuvent être sélectionnés individuellement sur le graphe et simultanément identifiés sur l’image pour vérifier s’ils doivent être inclus ou non dans le comptage. Il est ainsi possible de créer des protocoles personnalisés pour certaines lignées afin d’assurer une meilleure reproductivité.
Le Nucleocounter® NC-200™ est calibré et GMP-ready pour travailler dans des conditions conformes au 21 CFR part 11
Figure 3: Rapports pdf générés automatiquement. Les rapports pdf précis et documentés permettent d’assurer la traçabilité des mesures grâce aux signatures électroniques.
Le succès grandissant des essais cliniques actuels reposant sur des thérapies CAR-T nécessite des environnements de bioproduction en conditions GMP afin de garantir la sécurité du patient. Le NucleoCounter® NC-200™ peut facilement être intégré dans ce type de laboratoire GMP et conforme à la règlementation 21 CFR part 11. Les protocoles intégrés pour les QI/QO/QP garantissent l’homogénéité des procédures opérationnelles et les rapports pdf standardisés, les contrôles/groupes utilisateurs et l’audit trail assurent une traçabilité complète (Figure 3). Enfin, avec la Via1-Cassette™, les variations généralement introduites par les pipetages, le marquage ou le dénombrement spécifique de chaque opérateur sont évités, ce qui améliore de façon significative la robustesse et la précision des résultats.
Literature:
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