Pourquoi un comptage cellulaire cohérent est fondamental pour comprendre le développement embryonnaire précoce

Le Dr. Naomi Moris et son équipe du Francis Crick Institute utilisent des systèmes de cellules souches embryonnaires pour modéliser les premiers stades du développement embryonnaire humain. Leurs processus reposent sur un comptage cellulaire très précis et reproductible. C’est pour cela qu’ils ont récemment investi dans un NucleoCounter® NC-202™. Dans cet article, nous avons discuté avec le Dr. Peter Baillie-Benson, chercheur scientifique principal au sein du groupe Moris, pour mieux connaître leur travail et savoir pourquoi le comptage cellulaire est si important pour eux.

L’étude des embryons en développement peut nous aider à comprendre les mécanismes du développement humain et ce qui se passe lorsque ces mécanismes dysfonctionnent. Cependant, l’étude des embryons humains s’accompagne de considérations éthiques et de restrictions réglementaires, qui limitent leur durée d’utilisation à des fins de recherche.

Le laboratoire Moris s’intéresse au processus de gastrulation. La gastrulation est une étape du développement embryonnaire précoce où l’embryon se transforme d’une simple couche de cellules épithéliales en une structure multicouche et multidimensionnelle. La gastrulation forme trois couches germinales embryonnaires, l’endoderme, l’ectoderme et le mésoderme, qui se développent plus tard en différentes parties du corps. En bref, la gastrulation constitue la première étape du plan d’organisation d’un organisme.

Étudier la gastrulation avec des systèmes de cellules souches

Gastruloïde vu au microscope

« La réglementation britannique vous permet d’étudier les embryons humains seulement jusqu’au 14ème jour ou jusqu’à l’apparition de la séquence primitive, selon que l’un ou l’autre se produise en premier. Nous ne pouvons donc pas poursuivre nos études au-delà des tout premiers stades de la gastrulation chez les embryons », explique Peter. En alternative, Peter et son équipe utilisent des gastruloïdes humains, des structures tridimensionnelles de cellules souches embryonnaires, pour modéliser la gastrulation.

« Notre travail s’articule autour d’un essai clé consistant à cultiver des cellules souches humaines dans des conditions d’auto-renouvellement. Ensuite, nous les agrégeons en nombres bien définis pour former de très petits amas de cellules comme des sphéroïdes 3D. Avec le temps, l’expression génétique de ces agrégats cellulaires détermine une polarisation et le développement d’un premier plan d’organisation du corps. Ces agrégats acquièrent une conformation tête-bêche, commencent à s’allonger et à exprimer certains gènes que l’on pourrait voir s’exprimer dans un embryon humain en cours de développement », dit-il. « Nous les étudions pendant environ 3 jours, ce qui est une période assez courte. Mais pendant ce temps-là, nous pouvons beaucoup apprendre sur l’expression de leurs gènes. »

Peter et son équipe espèrent que l’étude des gastruloïdes humains leur permettra de mieux comprendre le processus du développement de l’embryon et les anomalies du développement telles que les malformations congénitales. « Nous pouvons même nous servir des gastruloïdes pour dépister la tératogénicité potentielle des médicaments afin de déterminer si un composé particulier pourrait déréguler le développement de l’embryon et l’endommager. Cela pourrait nous aider à comprendre l’innocuité des médicaments et réduire en même temps l’utilisation de modèles animaux dans la recherche. » ajoute-il.

Pourquoi un comptage cellulairecohérent est-il si important?

« La raison pour laquelle le comptage cellulaire a été si important pour nous réside dans le fait que notre essai sur le gastruloïde humain fonctionne, pour commencer, en cultivant un nombre bien précis de cellules dans l’agrégat », explique Peter. « Leur densité doit être bien déterminée pour qu’elles atteignent un état leur permettant de s’auto-organiser en agrégats. »

« Quand on travaille avec des systèmes de cellules souches, il y a souvent une grande variabilité, notamment entre les lignées, les expériences et les utilisateurs. Nous essayons donc toujours d’éliminer cette variabilité et d’obtenir des résultats plus cohérents. Lorsqu’il fonctionne, cet essai fonctionne très bien, mais il est fondamental que le tout soit le plus cohérent possible », explique-t-il.

« Dans le cadre de notre protocole, nous commençons par étaler les cellules à une densité bien déterminée, puis nous les laissons environ 5 jours avant de former les agrégats. Toutefois, lorsque vous étalez les cellules à une densité bien déterminée, pour ensuite les développer, toute erreur lors de cette première mesure sera amplifiée », explique Peter. « La cohérence du comptage cellulaire est vraiment cruciale. Nous voulons savoir si, lorsque nous étalons 40 000 cellules, nous avons vraiment ce nombre dans la boîte de Petri et qu’il n’y aura pas une grande variation ».

Du comptage manuel au comptage automatisé des cellules

« Au début, nous effectuions tous les comptages manuellement à l’aide d’un hémocytomètre, mais cela limitait le débit puisqu’il fallait que l’opérateur soit formé pour le faire rapidement et avec précision », explique Peter. Le premier compteur automatisé de cellules qu’ils ont essayé utilisait des lames jetables et présupposait la préparation de suspensions à l’orange d’acridine et à l’iodure de propidium pour compter les cellules vivantes et mortes. Puisque ce système n’était pas cohérent, Peter a beaucoup de doutes quant à la variabilité liée à la manière dont les différents utilisateurs préparaient les suspensions et effectuaient les réglages sur le compteur cellulaire.

Peter savait qu’il avait besoin d’un instrument plus cohérent, mais aussi d’un compteur capable de fonctionner sur une large plage dynamique. « Le nombre de cellules avec lesquelles nous travaillons varie beaucoup. Nous étalons des dizaines de milliers de cellules dans des puits, mais lorsque nous préparons ces cellules, nous pouvons travailler avec un million, voire dix millions de cellules. Nous essayons alors de travailler sur deux ordres de grandeur : des dizaines de milliers aux millions. Notre compteur cellulaire devait absolument pouvoir suivre ce rythme ».

Cellules souches agrégées vues au microscope

« Autre chose importante pour nous : le compteur pouvait compter les cellules à l’intérieur d’amas ou de grappes. Cela est important car lorsque vous avez de nouveaux opérateurs dans le laboratoire, ils peuvent ne pas être aussi efficaces dans la réalisation de suspensions unicellulaires très faciles à compter. Vous devez alors disposer d’un compteur qui déterminera le nombre de cellules réellement présentes avant de les étaler », dit-il.

Test du NC-202™

« Nous avons fait un essai assez long du NC-202™, nous l’avons donc testé de manière approfondie », explique Peter.

« J’ai fait beaucoup de suspensions cellulaires à différentes dilutions et densités et je les ai soumises aux trois compteurs. Je regardais la variabilité des comptages répétés de la même suspension pour identifier le compteur le plus cohérent », dit-il.

Le NucleoCounter® NC-202™ a été conçu pour éliminer la variabilité inter-individuelle. Il utilise notre Via2-Cassette™ dont le volume est calibré individuellement. Celle-ci contient des colorants immobilisés et pré-dosés afin d’éliminer la variabilité lors de la préparation des échantillons. Le NC-202™ utilise également une mise au point fixe et des protocoles standardisés, de sorte qu’il n’y ait aucune variabilité causée par la façon dont les différents opérateurs utilisent le compteur.

« J’ai également vérifié que les comptages étaient justes sur une plage allant d’environ 1 sur 1000 à une suspension non-diluée, simplement pour m’assurer qu’il y avait une bonne plage dynamique de comptage. » Le NC-202™ a également fourni la large plage dynamique dont Peter et son équipe avaient besoin, en fournissant un comptage cellulaire fiable de 5 ×104 à 1 ×107 cellules/ml. Cet instrument se sert également de notre puissant algorithme de dégroupement pour compter avec précision les cellules agrégées.

Maintenant que Peter a trouvé un compteur cellulaire qui répond à ses besoins, lui et son équipe peuvent se concentrer sur l’important travail de compréhension de la gastrulation.

Pour en savoir plus sur les recherches du laboratoire Moris, vous pouvez visiter leur site Web ou lire une publication récente de son groupe de recherche.

Lectures complémentaires

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