La numération de cellules manuelle est la méthode standard de numération de cellules dans de nombreux laboratoires. Cependant, les résultats obtenus en comptant manuellement les cellules à l’aide du bleu de trypan et d’un hémocytomètre posent plusieurs problèmes.

La numération de cellules effectuée en ayant recours à la cytométrie en images et à des compteurs de cellules automatisés apporte une solution à ces sources d’erreur. Cet article présente un examen des méthodes de numération de cellules manuelle et automatisée.

Les cytomètres imageurs NucleoCounter® comptent les cellules en suspension, adhérentes et agrégées, ce qui permet une mesure rapide et précise des cellules dans les situations où les concentrations sont difficiles à estimer.

Cette méthodologie améliorée offre un immense avantage en termes de précision et de reproductibilité dans le cadre de la culture de cellules de mammifères.

Défis posés par la numération manuelle de cellules de mammifères

Le temps passé derrière le microscope à compter les cellules est à la fois laborieux et chronophage. Comme les cultures de cellules de mammifères sont des systèmes délicats, elles nécessitent une reproductibilité élevée des paramètres expérimentaux lors de leur initiation et pendant toute leur durée. Il est essentiel de connaître la concentration cellulaire spécifique et la viabilité d’un échantillon cellulaire pour garantir sa reproductibilité en sous-culture, pour surveiller ses taux de croissance ou pour assurer sa cryoconservation^1,2.

Cependant, la numération manuelle de cellules est souvent associée à de grandes variations dans le calcul de la concentration et de la viabilité des cellules. Les quatre plus grandes sources d’erreur induites par la numération de cellules manuelle sont :

1. La perception humaine de ce qui définit une cellule
2. Les erreurs de volume, de dilution et de pipetage
3. La détermination de la viabilité
4. Le comptage d’un nombre suffisant d’événements

1. La perception humaine de ce qui définit une cellule

2. Les erreurs de volume, de dilution et de pipetage

Bien que l’hémocytomètre contienne un volume donné, l’espace entre la chambre de numération et le couvercle en verre peut être légèrement plus important lorsque la chambre est remplie de liquide. Cette variation peut entraîner une sous-estimation du volume de l’échantillon, ce qui aboutit à une surestimation de la concentration cellulaire, conduisant elle-même à des erreurs liées à une estimation incorrecte du volume.

Le pipetage ou plusieurs dilutions consécutives peuvent également engendrer des inexactitudes volumétriques.

3. La détermination de la viabilité : au bleu de trypan ou en ayant recours au DAPI ?

Le bleu de trypan colore les cellules mortes dont la membrane cellulaire est perméable alors que les cellules viables ne sont pas colorées.

Lors de l’estimation manuelle de la viabilité cellulaire, le bleu de trypan est utilisé comme marqueur pour les cellules mortes. Comme l’intensité de la coloration peut varier dans un échantillon donné, il peut être difficile de déterminer si une cellule se colore positivement avec du bleu de trypan.

Étant donné que le bleu de trypan est toxique pour les cellules, les cellules viables finissent par être colorées si elles ne sont pas analysées dans un certain laps de temps, généralement dans les 5 à 30 minutes, selon les conditions de l’échantillon. Pour ces raisons, le recours au bleu de trypan est connu pour entraîner une sous-estimation de la viabilité des populations cellulaires et il faut faire preuve de prudent lorsque l’interprétation de la vitalité d’un échantillon repose sur cette méthode⁴. Par conséquent, sélectionner un colorant de liaison à l’ADN imperméable à la membrane tel que le 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour définir les cellules mortes augmentera la précision des déterminations de la viabilité.

4. Le comptage d’un nombre suffisant d’événements pour garantir l’obtention de calculs statistiquement significatifs

La numération de cellules manuelle dans l’hémocytomètre Neubauer est standardisée à dix chambres, ce qui correspond à un volume total compté de 1 µl¹. Cependant, la pratique standard de numération manuelle des cellules consiste généralement à compter ~100 cellules ou un volume spécifique tel que 0,4 µl, quelle que soit la concentration cellulaire. L’utilisation d’un volume et d’un nombre de cellules aussi réduits augmente l’effet des variables stochastiques. Si seulement 100 cellules sont comptées, la variation standard sera d’au moins 10 % en raison des limitations statistiques inhérentes à un échantillon de si petite taille, en supposant que la variation suit la distribution de Poisson.

Selon la distribution de Poisson, l’écart type attendu équivaut à la racine carrée du nombre d’événements enregistrés, même en l’absence de variations d’origine humaine.

Voici un court protocole pour effectuer cette démarche :

1. Prélevez au moins cinq aliquotes provenant du même échantillon cellulaire (par exemple, cinq tubes de 200 µl d’échantillon à tester dans chacun des échantillons). Mélangez bien l’échantillon avant de procéder à l’aliquotage
2. Demandez à cinq collègues de compter une aliquote chacun (sans se parler ni se communiquer de données !)
3. Comptez les cellules en utilisant votre hématimètre préféré et vos normes de numération habituelles. Ne comptez pas plus de carrés ou de cellules que vous ne le feriez en temps normal
4. Calculez le nombre de cellules pour chaque aliquote (voir la formule)
5. Calculez la moyenne arithmétique, l’écart type et le coefficient de variation en pourcentage (voir les formules)

Résultats :

CV = entre 0 et 5 % : Avez-vous triché ? Vous êtes un expert de la numération cellulaire !

CV = entre 5 et 15 % : Excellent ! Vous avez une bonne formation dans le domaine de la numération cellulaire

CV = ≥ 15 % : Votre score est dans la moyenne. La numération cellulaire manuelle entraîne souvent de grandes variations, ce qui introduit une incohérence des données entre les différentes configurations expérimentales et a un impact important sur la reproductibilité de votre recherche

Évitez les interférences humaines en utilisant la Via2-Cassette™

La Via2-Cassette™ a été conçue pour éviter les interférences humaines lors de la numération de cellules :

• Aucun biais humain n’influence les résultats :
  L’algorithme du logiciel définit une cellule en fonction de la fluorescence de l’acridine orange de manière cohérente pour chaque analyse.
• Les erreurs de pipetage sont éliminées lors de la coloration et de la manipulation des échantillons :
  Les cassettes sont préchargées avec de l’acridine orangeet du DAPI immobilisés afin de définir les populations totales de cellules et de cellules mortes
• Aucune erreur humaine n’est introduite dans les calculs :
  Le volume de la chambre de mesure des cassettes est pré-calibré afin de garantir l’obtention de résultats précis et reproductibles.
• Les données générées sont statistiquement significatives :
  L’appareil vous alertera si le nombre de cellules dans votre échantillon est trop élevé ou trop faible.

Vous pouvez facilement charger un échantillon cellulaire dans la cassette car il vous suffit d’immerger la pipette intégrée dans la suspension cellulaire et d’appuyer sur le piston.

La Via2-Cassette™ a été conçue pour déterminer la viabilité et la concentration cellulaire de manière rapide et efficace, en une seule étape. L’acridine orange colore la population totale de cellules tandis que le DAPI ne colore que les cellules mortes. En savoir plus.

Utiliser des compteurs de cellules automatisés pour augmenter la précision et la reproductibilité

Le NucleoCounter® conçu par ChemoMetec est l’appareil de numération de cellules automatisé le plus précis et le plus facile à utiliser⁵. Ces cytomètres en images reposent sur l’utilisation de la microscopie fluorescente des fluorophores pour détecter et analyser des cultures cellulaires. Ils utilisent des sources de lumière LED stables et à longue durée de vie, ainsi que des filtres d’émission fixes afin de limiter la variation au minimum. L’échantillon est excité avec des LED, puis la lumière passe à travers des filtres d’émission correspondant aux colorants. L’utilisateur charge l’échantillon, qui est coloré de manière automatique dans la cassette, avant de l’insérer dans l’appareil.

La lumière focalisée et filtrée des LED illumine la fenêtre d’échantillon de la Via2-Cassette™ et la caméra intégrée prend une photo de la distribution de la fluorescence dans l’échantillon. Ensuite, l’algorithme du logiciel de l’appareil analyse les images et calcule les résultats. Les appareils NucleoCounter® fournissent non seulement une plate-forme pour obtenir des données de qualité supérieure, mais permettent également de procéder à une inspection visuelle de celles-ci, car les images peuvent être visualisées à l’aide du logiciel fourni avec l’appareil.

Les lumières LED de l’appareil NucleoCounter® passent à travers un filtre d’excitation avant de traverser la Via2-Cassette™, qui contient l’échantillon. À ce stade, les fluorophores liés aux cellules émettent de la lumière, qui est focalisée et passée à travers un filtre d’émission pour améliorer le signal. La lumière émise focalisée est enregistrée par un appareil photo numérique.

Recours à des fluorophores pour procéder à la numération de cellules

La numération de cellules automatisé à l’aide de la Via2-Cassette™ (pour les appareils NucleoCounter®NC-202™ et NucleoCounter®NC-200™) ou la Via1-Cassette™ (pour les appareils NucleoCounter®NC-200™ et NucleoCounter®NC-3000™) repose sur deux colorants différents d’un point de vue spectral et biologique qui définissent le nombre total de cellules et les cellules non viables : l’acridine orange (AO) et le DAPI.

L’acridine orange est perméable aux cellules et se lie principalement aux acides nucléiques⁶, c’est-à-dire à l’ADN présent dans la cellule, ce qui en fait un colorant efficace pour compter le nombre total de cellules. Lors de son excitation à 505 nm, l’acridine orange émet une fluorescence verte avec une émission maximale à 525 nm.

Le DAPI, quant à lui, colore efficacement les cellules mortes, car les cellules vivantes sont imperméables à de faibles concentrations de DAPI (quelques µg par ml). Le DAPI émet une fluorescence bleue lorsqu’il se lie à des agrégats riches en AT dans le sillon mineur de l’ADN à double hélice⁷. Lors de son excitation à 365 nm, le DAPI émet une fluorescence bleue avec une émission maximale à 461 nm.

Les appareils NucleoCounter ® détectent l’interaction entre les cellules et le DAPI ou l’acridine orange grâce à l’utilisation de deux sources de lumière LED d’excitation différentes qui ont respectivement des longueurs d’onde de pointe à 365 nm et 505 nm. Un seul filtre d’émission bibande de 410-460 nm et 540-650 nm est utilisé pour détecter les émissions.

Références

1. MC Phelan: Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 2007; 36: 1.1.1-1.1.18.
2. RI Freshney: Basic Principles of Cell Culture. 2006; p. 1–22.
3. L Nielson, G Smyth and P Greenfield: Hemacytometer Cell Count Distributions: Implications of Non-Poisson Behavior. Biotechnology Progress. 1991; 7(6): p. 560-563.
4. D Shah, M Naciri, P Clee et al.: NucleoCounter – An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes. Cytotechnology: 2006; 51(1): p. 39-44.
5. JR Tennant: Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability.Transplantation. 1964; 2: p. 685-94.
6. E Robbins and PI Marcus: Dynamics of Acridine Orange-Cell Interaction. I. Interrelationships of acridine orange particles and cytoplasmic reddening. J Cell Biol. 1963; 18: p. 237-50. 10.1021/bi00388a057
7. M Kubista, B Akerman and B Nordén, Characterization of interaction between DNA and 4′,6-diamidino-2-phenylindole by optical spectroscopy. Biochemistry. 1987; 26(14): p. 4545-53.

Lectures complémentaires

• Webinaire : Quel est le niveau de précision de vos comptages cellulaires ?
• Webinaire : Pourquoi le bleu de trypan est toxique et dangereux ?
• Journal : Dévoiler les secrets : Comment compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre
• Journal : Révéler la précision de vos comptages manuels de cellules
• La gamme NucleoCounter® : Compteurs et analyseurs de cellules automatisés