Pourquoi le comptage précis des cellules est essentiel pour comprendre le développement embryonnaire précoce

Qu’est-ce qu’un compteur de cellules ?

Si vous lisez cet article, vous êtes très probablement familiarisé avec l’hémocytomètre, la méthode la plus courante pour compter les cellules.

Vous comprenez également que ce processus manuel nécessite des pipettes méticuleuses, une excellente vue et des pouces agiles.

Nous ne qualifierions pas l’hémocytomètre de compteur de cellules, mais plutôt d’outil utilisé pour compter les cellules.

Les compteurs de cellules sont des instruments qui permettent de dénombrer le nombre, la concentration et la viabilité des cellules dans un échantillon de cellules.

Ces machines sont souvent appelées « compteurs de cellules automatisés ». Les types de cellules les plus souvent dénombrés comprennent les cellules sanguines, les cellules de mammifères, les cellules d’insectes et les cellules de levure.

Les compteurs de cellules ne se contentent pas de compter les cellules, ils réalisent également les actions suivantes :

• Calculer la viabilité cellulaire
• Présenter visuellement les données
• Stocker les données en toute sécurité
• Permettre l’exportation des données

Les informations fournies par le compteur de cellules de laboratoire moderne sont utilisées pour la production, la fabrication et le contrôle de la qualité liés aux bioprocédés.

Comment les compteurs de cellules comptent-ils les cellules ?

Bien que le dénombrement des cellules puisse sembler relativement simple, les compteurs de cellules effectuent une tâche assez complexe.

Les compteurs de cellules doivent être capables d’identifier les cellules, de distinguer les cellules mortes des cellules vivantes et d’exclure les particules non cellulaires du décompte.

Les avancées dans la puissance de calcul, l’optique et l’apprentissage automatique permettent de réaliser tout cela de manière automatique.

Technologies des compteurs de cellules

Il existe trois principes fondamentaux selon lesquels les compteurs de cellules fonctionnent aujourd’hui (voir tableau 1).

Ils comprennent :

• Imagerie
• Diffusion de la lumière laser
• Impédance électrique

Tableau 1. Résumé des compteurs de cellules automatisés et de leurs principes

Types de compteurs de cellules

Il existe plusieurs types d’instruments pour compter les cellules. Les principaux types comprennent :

• Analyseur d’hématologie
• Compteur à impédance
• Cytofluorimètre
• Cyto-imagerie

Discutons un peu plus en détail de chacun d’entre eux. Mais d’abord, parlons de l’hémocytomètre, la plus ancienne méthode de comptage des cellules encore utilisée.

Hémocytomètre

L’hémocytomètre est une lame de verre avec une chambre centralisée (appelée chambre de comptage) contenant votre échantillon de cellules. Une grille est gravée sur cette chambre et utilisée pour compter les cellules lorsqu’elles sont observées au microscope.

La version la plus contemporaine de cela est appelée chambre de comptage améliorée de Neubauer, bien qu’il existe une variété de chambres de comptage produites.

Les cellules sont identifiées dans l’hémocytomètre en utilisant la microscopie en champ clair.

La viabilité est déterminée selon le principe de l’exclusion du bleu de trypan ; le bleu de trypan colore les cellules non viables ou mortes, mais exclut les cellules viables. Les cellules viables et non viables sont ensuite décomptées sous un microscope.

Le comptage de cellules avec un hémocytomètre a été la méthode dominante pendant un certain temps et reste populaire aujourd’hui en raison de son faible coût, mais présente certains problèmes courants.

Erreur humaine et biais

L’hémocytomètre fonctionne correctement pour les cellules faciles à visualiser et à compter, telles que les cellules Jurkat ou les cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO).

Mais toutes les cellules ne sont pas aussi faciles. Les cellules agrégées ou les échantillons de cellules présentant une faible viabilité cellulaire et une quantité importante de débris sont plus difficiles à visualiser et à compter à l’œil nu.

La nature manuelle de cette méthode implique l’introduction de subjectivité et de biais à différentes étapes du processus. Par exemple, des différences dans la technique de pipetage lors de la préparation d’un échantillon de cellules peuvent introduire une erreur humaine.

Les différences dans la technique de comptage et la détermination de l’apparence d’une cellule sous le microscope introduisent encore plus d’erreurs.

Le résultat: de larges variations dans le décompte des cellules entre les utilisateurs et des données scientifiques compromises.

Pour le vérifier par vous-même, demandez à quelques collègues de compter les cellules avec vous. Calculez l’écart type et le coefficient de variation de vos décomptes. Comparez les résultats. Dans quelle mesure vos résultats étaient-ils concordants ?

Un autre problème avec les hémocytomètres (ainsi que certains autres compteurs de cellules) est l’utilisation du bleu de trypan, qui endommage les cellules, conduisant généralement à une surestimation de la viabilité cellulaire.1,2 Cette coloration est également toxique et est progressivement éliminée de l’Union européenne.

Voici les avantages et les inconvénients de l’utilisation d’un hémocytomètre pour compter les cellules.

Avantages:
✅ Coût réduit
✅ Bonne formation pour ceux qui découvrent le comptage cellulaire
✅ Considéré comme une méthode de référence

Inconvénients:
❌ Imprécision et subjectivité
❌ Laborieux et chronophage
❌ Variation importante entre les utilisateurs
❌ Pas d’enregistrement électronique

Mais ne paniquez pas ! Il existe de nombreuses autres façons de compter les cellules, qui sont décrites ci-dessous.

Analyseur d’hématologie

Les analyseurs d’hématologie sont des compteurs de cellules automatisés qui mesurent la concentration de cellules sanguines, de plaquettes et d’hémoglobine.

Ils reposent sur certains des mêmes principes utilisés par les compteurs de cellules automatisés pour les cellules de mammifères, tels que la diffusion de la lumière et l’impédance électrique.

Cependant, ils sont principalement utilisés dans des environnements de soins de santé, tels que les cabinets médicaux, les hôpitaux, les services d’urgence, les cliniques et les laboratoires de recherche.

L’une des mesures les plus courantes obtenues par ces machines est la numération formule sanguine (NFS), qui comprend le dénombrement des globules rouges (GR) et des globules blancs (GB).

De plus, la différenciation des GB en trois ou cinq parties est également une mesure standard.

Ces données fournissent aux cliniciens des informations importantes sur la santé du patient et aident au diagnostic.

On ne choisirait pas entre un analyseur d’hématologie et un compteur de cellules automatisé pour les cellules de mammifères, car les analyseurs d’hématologie ne comptent que les cellules sanguines.

Compteurs de cellules basés sur l’impédance

L’impédance électrique est la plus ancienne méthode automatisée de comptage des cellules, développée par Wallace Coulter et brevetée en 1953.³

Cependant, ils ne se contentent pas de compter les cellules – ils sont en réalité mieux caractérisés en tant que « compteurs de particules » et ne peuvent pas distinguer les types de particules. Ils ont été utilisés pour étudier les cellules ainsi que les minéraux, l’argile, les métaux et les aliments.

L’impédance électrique est souvent interchangée avec le « principe de Coulter » et fait référence au même concept. Les instruments utilisant ce principe sont souvent appelés des compteurs de Coulter.

Voici comment cela fonctionne.

En principe, les cellules, ainsi que le liquide et un courant électrique, sont pulsés à travers une très petite ouverture, appelée l’ouverture. De chaque côté de l’ouverture se trouvent des électrodes, qui créent une « zone de détection ».

Lorsqu’une cellule passe à travers l’ouverture, la machine détecte un changement de tension et l’enregistre sous la forme d’une impulsion de tension.

L’instrument compte alors le nombre d’impulsions de tension pour déterminer le nombre total de cellules dans l’échantillon.

Erreurs potentielles

L’erreur la plus courante avec les compteurs de cellules basés sur l’impédance implique l’entrée de plus d’une cellule dans la zone de détection et leur comptage erroné en tant qu’une seule particule.

Cela est appelé erreur de coïncidence et nécessite une dilution supplémentaire de l’échantillon de cellules avant d’être compté à nouveau.

Gardez à l’esprit…

Lors de l’utilisation d’un compteur de cellules basé sur l’impédance pour compter les cellules, des cellules en suspension sont généralement requises. Étant donné que ces instruments comptent les cellules une par une, les cellules agrégées et les types de cellules complexes ne peuvent pas être comptés par ces instruments.

De plus, l’instrument peut avoir des difficultés avec les échantillons de cellules primaires, qui sont souvent contaminés par des globules rouges.

Tant que vous avez préparé votre échantillon de cellules selon le bon protocole, le compteur de cellules basé sur l’impédance fournira un décompte absolu précis de votre échantillon de cellules.

Il peut également compter à la fois les cellules sanguines et les cellules non nucléées, et c’est pourquoi cette technologie est utilisée par de nombreux analyseurs d’hématologie.

L’impédance électrique ne nécessite pas non plus de coloration de l’échantillon, ce qui vous fait économiser une étape dans votre flux de travail, mais l’absence d’un marqueur de viabilité rend la viabilité dépendante uniquement des caractéristiques morphologiques détectées par l’impédance.

Voici les avantages et les inconvénients de cette technologie.

Avantages:
✅ Comptage précis des particules et de leur taille
✅ Comptage rapide des cellules
✅ Pas besoin de colorer les échantillons

Inconvénients:
❌ Erreurs de coïncidence
❌ Impossible de compter les cellules agrégées
❌ Faible précision pour la viabilité

Cytomètres en flux

Les cytomètres en flux sont des analyseurs de cellules à haut débit fournissant des données sur plusieurs paramètres cellulaires. Ils fonctionnent selon le principe de la diffusion de la lumière laser.

Après que la machine ait acquis l’échantillon, les cellules s’écoulent une par une à travers un tube étroit, où elles rencontrent la lumière laser.

La lumière est ensuite diffusée dans différentes directions, fournissant des informations sur les caractéristiques cellulaires intrinsèques et extrinsèques.

Les cytomètres en flux sont bénéfiques pour l’analyse cellulaire individuelle, les diagnostics in vitro et la recherche médicale.

Similairement aux compteurs basés sur l’impédance, les cytomètres en flux font passer les cellules en file indienne, ce qui leur permet de compter le nombre absolu de cellules dans votre échantillon.

Cependant, les cellules sont analysées en fonction du temps et non du volume, ce qui signifie que le mélange avec des billes de référence peut être nécessaire.

Gardez à l’esprit…

Pour préparer un échantillon de cellules pour la cytométrie en flux, vous devrez compter les cellules par d’autres moyens pour obtenir la bonne concentration.

C’est pourquoi un cytomètre en flux encombrant n’est pas un choix populaire lorsque des comptages cellulaires rapides et faciles sont nécessaires.

Comme les compteurs basés sur l’impédance, les cytomètres en flux nécessitent des cellules en suspension, car les cellules s’écoulent une par une dans le flux de fluide.

Cette exigence signifie qu’un processus fastidieux de préparation de l’échantillon précède le décompte des cellules. La préparation de l’échantillon peut prendre des heures avec un cytomètre en flux.

Les cytomètres en flux automatisés soulagent une partie de cette charge, mais le processus est toujours long et généralement beaucoup plus lent pour mesurer le nombre de cellules par rapport à d’autres méthodes.

De plus, les cytomètres en flux doivent être calibrés avant chaque utilisation et nettoyés par la suite. En raison du système de fluidique étendu, ils peuvent également se boucher de temps en temps, ce qui peut être coûteux à réparer et nécessite des soins particuliers.

La bonne nouvelle est que les compteurs de cellules dédiés et les cytomètres en flux font souvent partie du même flux de travail.

Par exemple, lors de l’étude de l’activité de médicaments anticancéreux, les chercheurs peuvent étudier comment un médicament déclenche l’apoptose.

Le décompte des cellules nous informe de l’étendue de l’apoptose et les essais d’apoptose sur un cytomètre en flux révèlent comment le médicament déclenche l’apoptose.

Voici quelques avantages et inconvénients de l’utilisation d’un cytomètre en flux pour le décompte des cellules.

Avantages:
✅ Reproductible
✅ Technologie automatisée, disponible en mode sans surveillance
✅ Compte et analyse des échantillons hétérogènes

Inconvénients:
❌ Calibration et nettoyage quotidiens nécessaires
❌ Temps de démarrage et d’arrêt
❌ Encombrant et coûteux
❌ Non basé sur le volume

Cytomètres d’images

Les compteurs de cellules basés sur l’imagerie, ou cytomètres d’images, fonctionnent de manière similaire à l’hémocytomètre – la différence est que le microscope est à l’intérieur de l’instrument et qu’un algorithme compte les cellules au lieu d’un être humain.

Dans le cytomètre d’images se trouvent des microscopes, des caméras et des lumières utilisés pour visualiser un échantillon de cellules.

L’échantillon de cellules est réparti dans une chambre mince d’une lame ou d’une cassette, qui est placée à l’intérieur de l’instrument.

Le cytomètre d’images prend ensuite plusieurs images de l’échantillon de cellules dispersées.

Son logiciel identifie les cellules vivantes et mortes, fournissant un calcul du décompte des cellules, de la viabilité et de la concentration.

Préparation de l’échantillon

Contrairement aux compteurs de cellules basés sur l’impédance et aux cytomètres en flux, les cytomètres d’images automatisés nécessitent généralement une préparation minimale voire nulle de l’échantillon.

Certains peuvent compter les cellules agrégées et distinguer les particules non cellulaires des cellules de votre échantillon également.

C’est un défi que tous les cytomètres d’images ne réussissent pas avec succès.

Gardez à l’esprit…

Certains compteurs de cellules basés sur l’imagerie effectuent également une analyse cellulaire. Ces instruments comprennent une gamme de tests et peuvent constituer une alternative moins chère et plus efficace à la cytométrie en flux. Cependant, les cytomètres en flux ont de plus grandes capacités.

Pensez aux types de colorants utilisés par un cytomètre d’images. Certaines machines sont basées sur le bleu de trypan, tandis que d’autres utilisent des colorants fluorescents tels que l’acridine orange (AO), l’iodure de propidium (PI) ou le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).

Si votre échantillon de cellules de mammifères est contaminé par des globules rouges, un compteur de cellules utilisant des colorants fluorescents est nécessaire pour différencier les cellules nucléées des cellules non nucléées.

L’achat de colorants et de réactifs peut augmenter le coût global de l’utilisation d’un compteur de cellules basé sur l’imagerie à long terme.

Un autre élément à prendre en compte est la technique de mise au point du microscope. Certains compteurs de cellules basés sur l’imagerie nécessitent que l’utilisateur effectue manuellement la mise au point du microscope avant de visualiser les cellules, tandis que d’autres offrent une mise au point automatique ou fixe.

La mise au point manuelle introduit une subjectivité dans vos décomptes de cellules, entraînant une plus grande variation d’un utilisateur à l’autre.

Les différences entre les cytomètres d’images sur le marché se situent principalement autour des méthodes de coloration, de la préparation de l’échantillon, de la plage dynamique de la machine (la concentration de cellules qu’elle peut compter) et de la précision du décompte des cellules.

Dans l’ensemble, les compteurs de cellules basés sur l’imagerie sont plus petits, portables et plus rentables que les cytomètres en flux.

Voici quelques avantages et inconvénients de ce type d’instrument.

Avantages:
✅ Pas de calibration quotidienne
✅ Faible maintenance
✅ Portable et peu encombrant

Inconvénients:
❌ Peut nécessiter des étapes de coloration ou de dilution manuelles
❌ La mise au point peut être subjective
❌ Peut nécessiter du bleu de trypan – un colorant toxique

À quoi servent les compteurs de cellules ?

Les compteurs de cellules sont utilisés dans la recherche scientifique et l’industrie pour une grande variété d’applications.

Jetons un coup d’œil à certains des domaines les plus intéressants et pertinents où des compteurs de cellules précis et fiables sont régulièrement utilisés.

Fabrication de thérapies cellulaires et géniques

Les thérapies cellulaires et géniques (TCG) ont été une percée en médecine, permettant la possibilité de médicaments personnalisés avec un potentiel curatif. Le marché des thérapies cellulaires et géniques devrait continuer à croître au cours de la prochaine décennie, la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis s’attendant à approuver entre 10 et 20 produits TCG chaque année d’ici 2025.³

Ces produits comprennent les thérapies à base de lymphocytes T portant un récepteur antigénique chimérique (CAR T) et les thérapies à base de cellules tueuses naturelles (CAR NK), les thérapies à base de cellules souches et les thérapies géniques. Tout au long des étapes de fabrication de ces produits, il est nécessaire de compter les cellules.

Dans la fabrication de la thérapie cellulaire CAR T autologue par exemple, les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMNBP), les lymphocytes T et la concentration des cellules CAR T sont mesurées à l’aide d’un compteur de cellules fiable.

Avant qu’une thérapie CAR T ne puisse être commercialisée, des tests de libération sont effectués. Une partie de ces tests consiste à mesurer le nombre de cellules et leur viabilité, parmi d’autres caractéristiques de qualité clés. La validation des procédés, les tests en cours de processus et la recherche et le développement visant à améliorer le processus de fabrication nécessitent également le décompte des cellules.

Bioproduction

De nombreuses protéines dépendent de modifications correctes lors de leur production – cela vaut également pour les protéines thérapeutiques. Les cellules sont le seul outil de fabrication pouvant être utilisé pour produire des antigènes à usage vaccinal ainsi que des protéines thérapeutiques telles que des anticorps souvent utilisés pour les traitements contre le cancer.

À cette fin, différentes lignées cellulaires ont été développées pour des produits biologiques spécifiques. L’une des lignées cellulaires les plus couramment utilisées pour la fabrication de produits biologiques est celle des cellules CHO.

Les compteurs de cellules jouent un rôle important dans le processus de fabrication de ces thérapies, que ce soit avec des modèles de culture cellulaire traditionnels ou lorsque les cellules sont cultivées dans un bioréacteur. Le nombre de cellules viables utilisées dans les processus en amont peut influencer la qualité du produit, le rendement et ses caractéristiques. Le décompte des cellules et leur viabilité doivent être mesurés régulièrement pour suivre la santé et la croissance des cellules.

La surveillance de la concentration et de la viabilité des cellules est également cruciale lors du développement de vaccins recombinants et basés sur les cellules. Dans tout bioprocédé nécessitant des cellules, la concentration cellulaire peut devenir un paramètre critique du processus. En utilisant une méthodologie fiable de comptage des cellules, les fabricants peuvent garantir l’efficacité du processus, réduire les temps d’arrêt et optimiser les rendements.

Criblage de médicaments

Une application importante des compteurs de cellules dans l’industrie pharmaceutique traditionnelle est le criblage de médicaments in vitro. À cette fin, des cultures cellulaires en 2D et 3D sont utilisées pour étudier la sécurité d’un médicament et son effet sur une maladie.

L’utilisation de cultures cellulaires vise à créer un modèle de cellules qui imite le comportement des cellules dans le corps humain. Avant qu’un médicament expérimental puisse être testé chez l’homme, il est d’abord testé in vitro pour sa toxicité et pour comprendre davantage son mécanisme d’action.

Dans le criblage des médicaments contre le cancer par exemple, des cellules tumorales sont exposées à des doses variables d’un médicament anticancéreux. Le décompte des cellules et leur viabilité sont mesurés à l’aide de compteurs de cellules pour comprendre l’effet du médicament sur la prolifération et la mort cellulaire.

La toxicité des médicaments peut être déterminée en exposant des lignées cellulaires humaines, telles que les cellules HeLa, à différentes concentrations du médicament.4 Les modèles de culture cellulaire sont également utiles pour personnaliser le traitement du cancer. Les cellules tumorales de patients individuels peuvent être cultivées pour tester différents médicaments contre le cancer ou des combinaisons de médicaments afin de déterminer le traitement le plus efficace.^5,6

Ces méthodes sont complexes et en constante évolution, mais déterminer de manière fiable le décompte des cellules et leur viabilité restera important.

Production de viande de culture

Le besoin de compteurs de cellules dans la production de viande de culture, également connue sous le nom de viande cultivée ou de viande de laboratoire, est similaire à celui des systèmes de culture cellulaire. Les cellules souches sont obtenues à partir d’une partie idéale d’une vache par biopsie tissulaire et sont cultivées dans des bioréacteurs.⁷

Finalement, les cellules souches se différencieront en tissu musculaire et adipeux, ce qui donnera un produit similaire en goût, en consistance et en valeur nutritionnelle à la viande. Les décomptes cellulaires sont obtenus avant de semer les cellules et de déterminer la densité cellulaire du produit final. Pendant la phase de prolifération des cellules souches, les compteurs de cellules sont régulièrement utilisés pour suivre le processus.

Après que Singapour soit devenu le premier pays à approuver la viande de culture en 2020, l’anticipation que l’Union européenne et les États-Unis pourraient suivre a commencé à monter. La viande de culture est présentée comme une alternative durable à la viande conventionnelle, nécessitant moins de ressources et sans exploitation animale.

De nombreux obstacles restent à surmonter avant que la viande de culture puisse être fabriquée commercialement en Europe et aux États-Unis, mais la perspective de manger un hamburger cultivé en laboratoire fait beaucoup parler.

Élevage animal

Les compteurs de cellules sont largement utilisés dans l’élevage sélectif à la fois d’animaux de production et d’animaux de compagnie par insémination artificielle.

Pour les animaux de production tels que les taureaux et les verrats, l’élevage d’animaux génétiquement supérieurs aide les agriculteurs à optimiser la production, à augmenter la longévité des animaux et à avoir un impact plus favorable sur l’environnement. Les étalons et les chiens, quant à eux, sont principalement élevés pour leur désirabilité et leurs loisirs.

Pour maximiser la fertilité, les échantillons de sperme doivent avoir une concentration et une viabilité optimales des spermatozoïdes, telles que mesurées par un compteur de cellules.

Conclusion

Les compteurs de cellules se retrouvent dans une grande variété d’applications. Avec un appel aux processus automatisés dans la bioproduction, la demande de compteurs de cellules automatisés devrait continuer de croître.

Le décompte des cellules ne doit pas être fastidieux, il doit être facile et fiable, afin que vous puissiez avoir confiance dans votre processus et vos résultats.

Bon décompte des cellules !

Références

1. Mascotti K, McCullough J, Burger SR. HPC viability measurement: trypan blue versus acridine orange and propidium iodide. Transfusion (Paris). 2000;40(6):693-696. doi:10.1046/J.1537-2995.2000.40060693.X

2. Tsaousis KT, Kopsachilis N, Tsinopoulos IT, Dimitrakos SA, Kruse FE, Welge-Luessen U. Time-dependent morphological alterations and viability of cultured human trabecular cells after exposure to Trypan blue. Clin Exp Ophthalmol. 2013;41(5):484-490. doi:10.1111/CEO.12018

3. Gottlieb S. Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, M.D. and Peter Marks, M.D., Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics

4. Cai L, Qin X, Xu Z, et al. Comparison of Cytotoxicity Evaluation of Anticancer Drugs between Real-Time Cell Analysis and CCK-8 Method. ACS Omega. 2019;4(7):12036-12042. doi:10.1021/acsomega.9b01142

5. Gorshkov K, Chen CZ, Marshall RE, et al. Advancing precision medicine with personalized drug screening. Drug Discov Today. 2019;24(1):272. doi:10.1016/J.DRUDIS.2018.08.010

6. Mitra A, Mishra L, Li S. Technologies for deriving primary tumor cells for use in personalized cancer therapy. Trends Biotechnol. 2013;31(6):347. doi:10.1016/J.TIBTECH.2013.03.006

7. Melzener L, Verzijden KE, Buijs AJ, Post MJ, Flack JE. Cultured beef: from small biopsy to substantial quantity. J Sci Food Agric. 2021;101(1):7-14. doi:10.1002/jsfa.10663