Lorsqu’on parle de comptage cellulaire on parle inévitablement du bleu de trypan. La plupart d’entre nous associe la couleur bleue, caractéristique des cellules colorées, à la préparation d’échantillons biologiques pour la microscopie. Le bleu de trypan est devenu un élément constant dans tous les laboratoires du monde réalisant le comptage cellulaire et l’étude de la viabilité cellulaire. À l’origine, ce colorant a été synthétisé par Paul Ehrlich en 1904 pour traiter la trypanosomiase chez la souris¹. Depuis son invention, la coloration des cellules non viables a connu une énorme popularité dans le cadre du comptage cellulaire. Cependant, l’enthousiasme suscité par cette coloration s’estompe en raison de sa toxicité et de ses possibles effets cancérigènes².

L’article de ce blog vous présente :

• Les considérations critiques à faire avant d’utiliser le bleu de trypan
• Les alternatives au bleu de trypan

La raison pour laquelle vous devez immédiatement remplacer le bleu de trypan dans votre laboratoire !

Quatre colorations alternatives pour l’étude de la viabilité cellulaire

Pour réduire au minimum l’utilisation du bleu de trypan dans l’étude de la viabilité cellulaire, nous sommes obligés d’opter pour des produits substitutifs. Ci-après, vous trouverez une liste de quatre colorations cellulaires, dont certains équivalents au bleu de trypan.

1. L’iodure de propidium (IP) peut colorer l’ADN ou l’ARN des cellules non-viables dont les membranes sont endommagées. Cependant, d’après certains rapports, l’utilisation de l’IP entraîne une sous-estimation de la viabilité cellulaire, contrairement au bleu de trypan qui peut engendrer une surestimation³. L’IP n’est pas classé comme étant cancérigène⁴.
2. L’érythrosine B colore les cellules non-viables car la membrane cellulaire perméable de ces cellules laisse pénétrer le colorant. N’étant pas classée comme cancérigène et n’est pas toxique, c’est aussi pour cela que l’érythrosine B est couramment utilisée en tant que colorant alimentaire^5,6.
3. L’acridine orange (AO) colore toutes les cellules en vertu de son interaction avec l’ADN. En raison de sa perméabilité membranaire, ce colorant permet de déterminer le nombre total de cellules d’un échantillon. Selon l’Agence européenne des produits chimiques (AEPC), l’AO n’est pas cancérigène^7,8.
4. Le dichlorhydrate de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ne peut pas pénétrer la membrane cellulaire, par conséquent, il convient à la coloration des cellules non-viables. L’ADN de ces cellules est exposé car leurs membranes cellulaires et nucléaires sont perméables. Contrairement au bleu de trypan, le DAPI n’est pas cancérigène^7,9.

Pour le calcul de viabilité dans le cadre d’une étude de ce type, il est donc judicieux d’utiliser différents colorants pouvant donner à la fois le nombre total de cellules et le nombre de cellules non-viables. Ici, l’association de l’AO, qui produit une fluorescence, et du DAPI, donnera un aperçu de l’état des cellules de l’échantillon. Souhaitez-vous en savoir davantage ? Découvrez comment la Via2-Cassette™ utilise ces colorants.

En savoir plus

Vous voulez mieux comprendre les problèmes découlant de l’utilisation du bleu de trypan dans le cadre du comptage cellulaire ? Suivez le webinaire sur le bleu de trypan de ChemoMetec qui comprend de courtes présentations et une section réservée aux réponses aux questions des clients. Ou accédez à l’une de ces ressources :

• Webinar: Mesurer avec précision la viabilité cellulaire: Les colorants de viabilité sont-ils tous équivalents ?
• Webinar: Pourquoi le bleu de trypan est toxique et dangereux ?
• Comptage cellulaire: Numération de cellules automatisée vs numération manuelle
• Bleu de trypan: Pourquoi travailler avec du bleu de trypan n’est pas une bonne idée
• Produit: Via2-Cassette™

Références

1. HP Morgan, IW McNae, MW Nowicki et al.: The Trypanocidal Drug Suramin and Other Trypan Blue Mimetics Are Inhibitors of Pyruvate Kinases and Bind to the Adenosine Site, Journal of Biological Chemistry, Volume 286, Issue 36, 2011, p. 31232-31240
2. European Chemical Agency (ECHA): Substance Infocard: Tetrasodium 3,3′-[(3,3′-dimethyl[1,1′-biphenyl]-4,4′-diyl)bis(azo)]bis[5-amino-4-hydroxynaphthalene-2,7-disulphonate]
3. C Kirchhoff, H Cypionka, Propidium ion enters viable cells with high membrane potential during live-dead staining. Journal of Microbiological Methods, Volume 142, 2017, p. 79-82
4. European Chemical Agency (ECHA): Substance Infocard: 3,8-diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide
5. European Chemical Agency (ECHA): Substance Infocard: Erythrosin B
6. S Kamiloglu, G Sari, T Ozdal et al.: Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers, 2020.
7. European Chemical Agency (ECHA): Substance Infocard: N,N,N’,N’-tetramethylacridin-3,6-yldiamine hydrochloride
8. ChemoMetec: Pourquoi travailler avec du bleu de trypan n’est pas une bonne idée
9. European Chemical Agency (ECHA): Substance Infocard: 2-phenylindole-4′,6-dicarboxamidine dihydrohydrochloride (hydrate)