Oncologie

Comptage et analyse des cellules cancéreuses

Que les chercheurs travaillent sur la découverte des facteurs génétiques ou sur les facteurs environnementaux affectant le développement du cancer, l’étude des cellules cancéreuses individuelles est essentielle pour identifier les causes possibles des types de cancer individuels. Le cancer étant l’une des principales causes de mortalité dans le monde, le développement de nouveaux traitements pour lutter contre le cancer est d’une importance capitale. Pour cette raison, la recherche sur le cancer nécessite une analyse cellulaire rapide, fiable et détaillée.

Le NucleoCounter® NC-3000™ offre une analyse rapide du cycle cellulaire et une gamme complète de tests d’apoptose prêts à l’emploi permettant à l’utilisateur d’effectuer des analyses détaillées de la vitalité des cellules cancéreuses. Les instruments NucleoCounter® sont également en mesure de déterminer la viabilité et le nombre de cellules cancéreuses avec précision et rapidité extrêmes, même lorsqu’elles sont cultivées dans des microsupports ou des sphéroïdes.

Analyse des cycles cellulaires

Contrairement aux cellules normales, les cellules cancéreuses subissent une division cellulaire incontrôlée en raison de mutations dans les gènes qui habituellement réguleraient le cycle cellulaire, ce qui aboutit souvent à la formation de tumeurs solides. Par conséquent, les études portant sur le cycle cellulaire sont essentielles pour comprendre les cancers et constituent l’un des outils les plus puissants dans ce domaine de recherche.

Le NucleoCounter® NC-3000™ permet une analyse rapide et facile du cycle cellulaire en moins de cinq minutes appelée test de cycle cellulaire en deux étapes. Après l’ajout d’un tampon de lyse associé à un colorant ADN fluorescent, tous les noyaux cellulaires seront colorés. Le NC-3000™ peut alors mesurer et analyser l’échantillon.

Le logiciel NucleoView™ qui accompagne l’instrument affiche instantanément un profil de cycle cellulaire, vous permettant d’identifier les événements en sous-phase G1, phase G0/G1, phase S et phase G2/M. Grâce à son progiciel FlexiCyte™, le NucleoCounter® NC-3000™ peut même être utilisé pour étudier la prolifération cellulaire. En détectant l’incorporation de BrdU et d’EdU à l’aide d’anticorps marqués par fluorescence, ce test permet de réaliser des études approfondies de la prolifération cellulaire.

Les différentes phases du cycle cellulaire peuvent être distinguées en fonction de la teneur en ADN à l’aide d’un colorant ADN fluorescent (image, à gauche).

Le test du cycle cellulaire en deux étapes de cellules Jurkat non traitées et traitées par la camptothécine (CPT) montre l’intensité de la coloration de l’ADN par le DAPI et peut être utilisé pour définir les événements du cycle cellulaire dans la sous-phase G1, la phase G0/G1, la phase S et la phase G2/M. Après le traitement à la CPT, le cycle cellulaire est arrêté dans la phase G2/M (image, à droite). La CPT est un inhibiteur de la topoisomérase et certains de ses dérivés sont utilisés comme médicaments anticancéreux.

Schéma du cycle cellulaire (à gauche) et schémas de la distribution des cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire selon les conditions (à droite).

Méthodes d’analyse prêtes à l’emploi avec le NucleoCounter® NC-3000™

Comptage cellulaire
Détermination du nombre et de la viabilité des cellules : Numération cellulaire de haute précision de cellules de mammifères, d’insectes et de levures à partir d’une variété de types d’échantillons et de cultures.

Apoptose

Test du potentiel de membrane mitochondriale : Analyse de l’apoptose précoce ; détecte les changements du potentiel mitochondrial
Dosage de l’annexine V : Analyse des phases précoce à moyenne de l’apoptose ; détecte l’effondrement de l’asymétrie des phospholipides
Essai de l’activation des caspases : Analyse des phases précoce à moyenne de l’apoptose ; détecte les changements d’activité des caspases 3/7, 8 et 9
Test de vitalité (VB-48) : Analyse de la phase tardive de l’apoptose ; détecte les changements de thiols réduits
Analyse de la fragmentation de l’ADN : Analyse de la phase tardive de l’apoptose ; détecte l’ADN fragmenté (sous-G1)

Autres analyses

Méthodes de dosage du cycle cellulaire : Analyse unique du cycle cellulaire de 5 minutes sur des cellules vivantes ou fixées à l’aide de DAPI ou PI
Étude de l’efficacité de transfection de la GFP : Détecte les cellules transfectées et non viables par la GFP (au moyen des colorants Hoechst et PI)
Test FlexiCyte™ : Configuration de test définie par l’utilisateur avec LED, filtres d’émission et paramètres en option

Numération des cellules cancéreuses développées dans des sphéroïdes

Il existe un besoin croissant de développer des modèles plus représentatifs pour effectuer des tests in vitro de cytotoxicité et de criblage de médicaments en biologie des cellules cancéreuses. En effet, les cultures de cellules 2D conventionnelles ne peuvent pas imiter la complexité et l’hétérogénéité des tumeurs in vivo.

Plusieurs modèles 3D ont été développés, y compris des gouttes suspendues, des cultures de granulés, des cultures sphéroïdes et organoïdes. Ces modèles d’expansion et de criblage présentent un défi pour déterminer le nombre de cellules cancéreuses se développant dans des structures 3D ou sous forme d’organoïdes contenant plusieurs types de cellules pour imiter des tissus cancéreux entiers.

La famille d’instruments NucleoCounter® est livrée avec des tests finalisés au comptage et à la mesure de la viabilité des cellules, spécialement conçus pour les structures 3D. Grâce à l’utilisation d’un tampon de lyse pour briser les structures 3D, les tests garantissent un échantillon homogène de noyaux uniques qui peuvent ensuite être colorés avec du DAPI pour procéder à la détection et à l’analyse.

Viabilité et comptage cellulaire des cellules cancéreuses cultivées sur des micro-supports

La culture de cellules cancéreuses dans des sphéroïdes 3D peut être problématique en raison des gradients micro-environnementaux, tels que l’oxygène et les nutriments qui limitent les taux de croissance cellulaire. Outre cette méthode d’expansion sans échafaudage des cellules cancéreuses in vitro, les cellules cancéreuses peuvent également être cultivées à la surface de micro-supports et à l’intérieur de micro-supports macroporeux. Ces méthodes peuvent nous aider à étudier le rôle de la forme cellulaire et du contact cellulaire en réponse aux traitements contre le cancer.

Déterminer la concentration et la viabilité des cellules cultivées dans et sur des micro-supports est extrêmement difficile et nécessite d’avoir recours au processus fastidieux de détachement des cellules à l’aide d’enzymes. Les instruments NucleoCounter® offrent un protocole unique pour compter et déterminer la viabilité des cellules cultivées directement sur des micro-supports. Vous pouvez y parvenir en ajoutant une courte étape de lyse juste avant la numération, sans avoir besoin de procéder à une étape de détachement en amont.

Processus étape par étape de comptage de cellules sur microporteurs. Les cellules sont lysées, colorées au DAPI, puis comptées et vérifiées.

Lorsque les cellules sont lysées, les noyaux se retrouvent en suspension (Image A). L’ensemble des cellules sera coloré au DAPI et détecté par un NucleoCounter® (Image B). L’analyse réalisée par le logiciel permet à l’utilisateur de s’assurer que toutes les cellules ont été comptées correctement (Image C). Ensuite, les cellules non viables sont colorées avec du DAPI sans aucun prétraitement avec un tampon de lyse car toutes les cellules mortes sans adhérences cellulaires sont libres et en suspension, et ne sont plus attachées aux micro-supports.