Cellules souches mésenchymateuses (CSM)

Fiabilité dans le comptage cellulaire et dans la détermination de la viabilité des cellules à des fins de développement et de fabrication

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont un outil thérapeutique en médecine régénérative grâce à leur potentiel élevé de différenciation, combiné à une faible réponse à la maladie du greffon contre l’hôte. Les CSM peuvent être prélevées chez le patient qui sera traité par ces mêmes cellules (cellules autologues) ou chez des patients génétiquement distincts (cellules allogéniques).

L’intérêt pour l’étude des CSM est né lorsque les scientifiques se sont rendus compte que ces cellules pouvaient se différencier en les os, la graisse, le cartilage, les muscles et les neurones et qu’elles allaient pouvoir être des candidats intéressants pour les thérapies régénératives.

Les applications cliniques potentielles des MSC vont de la transplantation jusqu’à la régénération de tissus et même jusqu’à la thérapie des maladies auto-immunes telles que la maladie du greffon contre l’hôte. Les CSM sécrètent en outre des cytokines anti-apoptotiques et anti-angiogéniques et des facteurs de croissance pouvant contribuer au processus de guérison des tissus abîmés après un infarctus du myocarde ou à la cicatrisation des plaies. Les sources précieuses des CSM sont les aspirats de moelle osseuse, les prélèvements de tissus adipeux, de sang du cordon ombilical, de sang placentaire et de gelée de Wharton.

Les CSM ont un avenir prometteur dans les thérapies cellulaires allogéniques et autologues, toutefois le comptage de ces cellules reste difficile en raison de la grande quantité de matériel tissulaire. En effet, ce matériel peut être compté par erreur en tant que cellules proliférantes par d’autres méthodes de comptage cellulaire (pour plus d’informations, voir l’explication ci-dessous).

Surmonter les obstacles en matière de fiabilité du comptage et de la détermination de la viabilité des CSM

Pour la fabrication de la thérapie utilisant les CSM, les cellules sont isolées après liposuccion ou à partir de la moelle osseuse et ensuite purifiées, expansées, formulées et administrées au patient.

Les instruments NucleoCounter® fournissent une méthode fiable et précise pour mesurer efficacement la viabilité et le nombre total de MSC provenant de différentes sources. Les MSC dérivées du tissu adipeux peuvent être isolées dans la fraction stromale vasculaire (SVF) après liposuccion, tandis qu’une autre source précieuse de MSC sont les aspirats de moelle osseuse.

Les MSC peuvent être utilisées directement ou encore amplifiées et utilisées après un stockage à long terme dans le cadre de thérapies autologues ou allogéniques. À chaque étape de la production, le nombre de cellules et leur viabilité peuvent être déterminés de manière fiable à l’aide des instruments NucleoCounter®.

La Via2-Cassette™ combine échantillonnage, coloration et chargement de la chambre de comptage en une seule étape, garantissant ainsi reproductibilité et fiabilité d’un utilisateur à l’autre. Les dispositifs BFP dédiés au traitement des cellules tirent avantage de résultats fiables obtenus par des méthodes d’analyse rigoureuses et de la technologie intuitive du système NucleoCounter®.

Comptage des cellules souches mésenchymateuses adipeuses dans les tissus aspirés par liposuccion

Les MSC dérivées des tissus adipeux peuvent proliférer en culture et être isolées dans la fraction vasculaire stromale (SVF) après des biopsies graisseuses et liposuccions. Cette fraction contient une variété de cellules telles que les MSC, les cellules stromales, les cellules endothéliales, les adipocytes, les érythrocytes mais aussi des gouttelettes de lipide et des micelles. Dans le cadre des applications thérapeutiques cellulaires, la SVF peut être directement utilisée pour traiter les patients.

Quantifier avec précision le nombre total de cellules et leur viabilité pour d’autres applications est crucial. Il existe beaucoup d’autres techniques de comptage qui ne permettent pas d’opérer une distinction entre cellules et artéfacts. En outre, une quantité excessive de débris cellulaires provoque une adhérence qui entraîne un degré élevé d’agrégation cellulaire. En plus, les échantillons obtenus par aspiration de tissus ne sont pas homogènes et donneront des résultats variables selon l’utilisateur. Pour surmonter ces problèmes, les instruments NucleoCounter® offrent un protocole efficace pour déterminer le nombre de cellules et la viabilité des MSC dérivées d’adipocytes.

Pour déterminer la population cellulaire totale de la SVF avec NucleoCounter®, la suspension cellulaire est traitée à l’aide d’un agent de lyse, un procédé de lyse de cellules et d’autres particules enveloppées dans une membrane, pour colorer les noyaux cellulaires au DAPI au moyen de la Via2-Cassette®. Dans un second temps, les cellules non viables sont colorées au DAPI sans aucun prétraitement.

Pour compter les cellules FVS, il faut les lyser et les compter afin de connaître leur nombre total. Un échantillon est coloré au DAPI pour procéder ensuite au dénombrement des cellules mortes.

Puisque le DAPI se complexe à l’ADN, les instruments NucleoCounter® ne comptent que les cellules contenant de l’ADN nucléaire. Cet instrument ignorera donc les artefacts souvent observés dans la SVF et qui interfèrent avec la précision de la mesure, à savoir les fragments cellulaires, les micelles, les microvésicules et les gouttelettes de matière grasse. Cela inclut également les cellules sans noyau et donc sans ADN nucléaire telles que les érythrocytes et les plaquettes.

Comptage des CSM issues de la moelle osseuse

Pour isoler les CSM de la moelle osseuse, des biopsies ou des ponctions de moelle osseuse sont effectuées. Déterminer le nombre et la viabilité des MSC directement à partir d’échantillons de moelle osseuse est une tâche particulièrement difficile. La raison est que ces échantillons contiennent un niveau élevé en érythrocytes qui interfère avec les méthodes automatisées et manuelles de comptage.

Lorsque le ratio érythrocytes/globules rouges nucléés dépasse un certain seuil, il peut être conseillé de lyser les érythrocytes.

Pour compter les MSC directement et de manière fiable dans l’aspirat de moelle osseuse, les instruments NucleoCounter® se servent d’un protocole rapide de manipulation des érythrocytes dans l’échantillon. Les érythrocytes sont lysés en ajoutant un tampon de lyse sanguine à l’aspirat de moelle osseuse et en les incubant pendant une courte période.

Facile à utiliser et prêt pour être utilisé dans les environnements GMP

Le logiciel NC-View™ est conforme aux BPF car il prend en charge les signatures électroniques, les protocoles adaptés et les rapports PDF automatisés

Le logiciel intuitif associé au NucleoCounter® mesure automatiquement la viabilité cellulaire, le comptage de toutes les cellules, vivantes et mortes. NC-View™ vous permet d’inspecter l’image de fluorescence et de vérifier le comptage.

Les compteurs de cellules automatisés sont prêts à l’utilisation dans les installations BFP (GMP) appliquant les réglementations 21 CFR Part 11.

Grâce au flux de travail et à la pipette intégrés, la Via2-Cassette™ vous garantit un échantillonnage cellulaire fiable qui élimine la variance de production inhérente aux utilisateurs. De plus, les cassettes sont calibrées individuellement en volume pour un calcul le plus précis possible des cellules. Par conséquent, en vertu de leur conception, les cassettes évitent l’erreur humaine introduite autrement par le mélange des réactifs et le chargement des échantillons. Cela se traduit par un comptage cellulaire précis et reproductible largement supérieur au test d’exclusion au bleu de trypan.