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Détecter l’apoptose avec VitaBright

Analyse de la vitalité cellulaire en 1 minute

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– 5 minutes

Dans les cellules, les taux de composés thiols tels que le glutathion (GSH) par exemple, diminuent lors d’une réponse apoptotique. Pour mesurer ce phénomène, nous avons développé deux sondes fluorescentes réactives aux thiols, VitaBright-43™ et VitaBright-48™, pouvant être employées pour détecter l’apoptose par le test Vitality du NucleoCounter ® NC-3000™.

Utilisez VitaBright-43™ pour détecter les événements apoptotiques aux stades précoces et intermédiaires et VitaBright-48™ pour les événements apoptotiques aux stades intermédiaires et tardifs. Avec le NucleoCounter ® NC-3000™, l’analyse de vitalité ne prend qu’une minute et c’est une opération très facile. Vous pouvez analyser jusqu’à huit échantillons à la fois.

Détectez les événements apoptotiques précoces et tardifs

Tableau des sondes thiol et des propriétés des cellules qu’elles colorent
Les thiols libres jouent de nombreux rôles importants en biologie cellulaire. L’oxydant cellulaire prédominant est le glutathion réduit (GSH) qui protège contre les dommages causés par le stress oxydatif. L’état d’oxydation du GSH détermine fortement l’état de transition thiol-disulfure (GSSG) et, par conséquent, le potentiel redox intracellulaire1. Il a été observé que les taux de GSH diminuent lors de l’induction de l’apoptose à cause de l’extrusion de GSH, et également lors de l’induction de l’apoptose par des agents apoptogènes anti-oxydants2-5.

VitaBright-43™ et VitaBright-48™ sont des dérivés de maléimides perméables aux cellules qui réagissent avec les groupements thiols des protéines en donnant des composés, les thioesters, qui sont fluorescents6,7. Avec la cytométrie multicolore, il apparaît évident que, lors de l’induction de l’apoptose, une coloration VitaBright-43™ moins intense est corrélée à l’externalisation de la phosphatidylsérine et à l’augmentation de l’activité de la caspase-3/72. Cela fait de VitaBright-43™ la sonde idéale pour détecter précocement les événements apoptotiques aux stades précoce et intermédiaire.

Avec la solution VitaBright-48™, la coloration des cellules est moins intense aux derniers stades de l’apoptose et inversement corrélée à la coloration avec Annexine V, marqueur apoptotique. Elle est également moins intense après la perte de potentiel de membrane mitochondrial telle qu’elle est mesurée à l’aide d’un colorant JC-17. La solution VitaBright-48™ est donc un excellent marqueur de l’apoptose à un stade avancé.

Principe de coloration et analyse avec VitaBright

Lorsque la solution VitaBright est ajoutée à la culture cellulaire, elle traverse la membrane cellulaire et réagit immédiatement avec les thiols intracellulaires, formant un composé bleu fluorescent. L’intensité de la fluorescence bleue est directement corrélée aux taux intracellulaires de GSH. De plus, ces derniers et, par conséquent, le niveau de groupements thiols libres baissent lorsque l’apoptose est induite. La mesure du niveau de groupements thiols libres peut donc permettre de quantifier l’apoptose.

VitaBright vous offre un moyen très rapide, facile et fiable de doser l’apoptose par cytométrie en flux ou en image.

VitaBright réagit avec les thiols intracellulaires (à gauche) et crée un composé bleu fluorescent (à droite).
Puisque ces colorants ne nécessitent aucune opération préalable d’incubation ni de lavage, ils contribuent à la préservation des cellules apoptotiques qui sont fragiles et souvent perdues durant les étapes de lavage. Pour distinguer les cellules nécrotiques des cellules apoptotiques, la coloration VitaBright doit être combinée à une coloration imperméable, telle que l’iodure de propidium (PI).

Analyse de la vitalité des cellules Jurkat et WeHi-S

Cette image (à gauche) représentant l’essai Multiplex montre que la coloration VitaBright-43™ est bien corrélée à l’externalisation de la phosphatidylsérine et à l’activité de la caspase-3/7 dans les cellules Jurkat et Wehi-S. Au fur et à mesure que l’apoptose progresse, la surexpression d’Annexin V CF-647 et de NucView 488 augmente tandis que celle de VitaBright-43™ diminue dans un sous-ensemble de la population cellulaire.

Le tableau A montre des cellules Jurkat traitées avec 5 µM de camptothécine (CPT) pendant 0,2 et 4 heures, respectivement. Les cellules ont été marquées avec VitaBright-43™ (bleue), Annexine V CF-647 (rouge) et le colorant SYTOX vert (vert) et ensuite analysées par cytométrie en image à l’aide du NucleoCounter®NC-3000™.

Les cellules Jurkat (en haut) et WeHi-S (en bas) ont été analysées après coloration au VitaBright-43™, à l’Annexine V et au vert SYTOX. Les résultats sont présentés sous forme de diagrammes de dispersion et d’images de cellules.
Les diagrammes de dispersion comparent l’intensité de coloration avec VitaBright-43™ et Annexine V CF-647. Les cellules non viables ont été relarguées par absorption du vert SYTOX. Le dernier tableau à droite montre une image de l’échantillon traité à la CPT.

Le tableau B montre des cellules WeHi-S traitées avec 10 ng/pl de TNF-α pendant 0, 2 et 4 heures, respectivement. Les cellules ont été colorées avec VitaBright-43™ (bleu), NucView 488 (vert) et PI (rouge) et analysées par cytométrie en image avec NC-3000™. Les diagrammes de dispersion comparent l’intensité de VitaBright-43™ à celle de NucView 488. Les cellules non viables ont été relarguées par absorption de PI. Le dernier tableau à droite montre une image de l’échantillon traité au TNF-α.

Références

  1. SM Deneke and BL Fanburg: Regulation of cellular glutathione. Am J Physiol. 1989; 257(4 Pt 1):L163-73.
  2. L Ghibelli, S Coppola, G Rotilio et al.: Non-oxidative loss of glutathione in apoptosis via GSH extrusion. Biochem Biophys Res Commun. 1995; 216(1):313-20.
  3. AF Slater, CS Nobel, E Maellaro et al.: Nitrone spin traps and a nitroxide antioxidant inhibit a common pathway of thymocyte apoptosis. Biochem J. 1995; 306 (Pt 3):771-8.
  4. DJ v/d Dobbelsteen, CS Nobel, J Schlegel et al.: Rapid and specific efflux of reduced glutathione during apoptosis induced by anti-Fas/APO-1 antibody. J Biol Chem. 1996; 271(26):15420-7.
  5. A Macho, T Hirsch, I Marzo et al.: Glutathione depletion is an early and calcium elevation is a late event of thymocyte apoptosis. Immunol. 1997; 158(10):4612-9.
  6. ME Skindersoe, M Rohde and S Kjaerulff: A novel and rapid apoptosis assay based on thiol redox status. Cytometry A. 2012; 81(5):430-6.
  7. ME Skindersoe and S Kjaerulff: Comparison of three thiol probes for determination of apoptosis-related changes in cellular redox status. Cytometry A. 2014; 85(2):179-87.

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