La Via1-Cassette™ innovatrice – Supprimer l’erreur humaine

En comptant manuellement, l’évaluation subjective de la définition d’une cellule introduit un biais au résultat. Le NucleoCounter^® NC-200™ est conçu pour limiter l’interférence humaine dans le comptage. Avec la Via1-cassette™, toutes les erreurs introduites pendant le pipetage et la coloration sont évitées. Une pipette intégrée est incluse dans la Via1-cassette™ et les colorations fluorescentes immobilisées orange acridine et DAPI colorent automatiquement le nombre total de cellules et les cellules mortes respectivement. La Via1-cassette™ est calibrée en volume ce qui assure une haute précision dans la détermination du comptage de cellules et la viabilité. Au total, ce comptage et cette détermination de viabilité de cellules en une étape prend moins de 50 secondes.

Vérification visuelle du comptage de cellules

Même pour les tests simples de comptage de cellules et de viabilité, il est essentiel de définir la bonne population cellulaire à compter. L’avantage majeur de la cytométrie d’image avec le NC-200™ est la possibilité de lier les images obtenues avec les diagrammes fluorescents. Avec le logiciel accompagnant NucleoView™, c’est facile de définir précisément les points de comptage et ainsi seulement compter les bons évènements à l’intérieur des bonnes populations – pour les populations mortes et totales.

Figure 2. Le logiciel NucleoView™ permet une liaison facile entre les images obtenues, les diagrammes montrant la fluorescence et les réglages des points de comptage.

Comptage précis de cellules fortement agrégées

Avec le test pour cellules agrégées le NucleoCounter^® NC-200™ compte les cellules nucléées en colorant l’ADN avec la fluorescence. Basé sur un système de tampon de lyse, ChemoMetec A/S offre un protocole optimisé en deux étapes pour compter et déterminer la viabilité de cellules fortement agrégées. Dans la première étape, les cellules sont lysées et comptées par coloration fluorescente de l’ADN. Dans la deuxième étape, seulement les cellules mortes sont comptées. En seulement deux minutes, le NucleoCounter^® NC-200™ va rapporter la viabilité et le comptage de cellules.

Figure 3. Détermination de la concentration cellulaire et la viabilité de cellules agrégées MCF7 avec le NC-200™
Pour un comptage total de cellules (A), les cellules sont lysées avec la Solution 10 et colorées par le DAPI dans les Via1 cassettes™. Le comptage de cellules mortes a été déterminé dans un échantillon non lysé en utilisant aussi le DAPI des Via1 cassettes™ (B). Les résultats sont présentés en bas à droite de l’analyse et les résultats approfondis sont montrés dans la barre de résultats.

Note d’application (.PDF):
Test de comptage de cellules mammifères
Test de comptage de cellules agrégées – Réactifs A100 et B

Protocoles de comptage optimisés pour les cellules sur microporteurs

Le NucleoCounter^® NC-200™ offre un protocole unique pour compter et déterminer la viabilité de cellules sur microporteurs sans avoir besoin de les détacher. Avec les réactifs A100 et B, les cellules sont lysées les noyaux se retrouvent en suspension et sont comptés en utilisant le NC-200™ (Figure 4.). La détermination du nombre de cellules mortes est faire basée sur l’hypothèse que toutes les cellules mortes sont libres en suspension et ne sont plus attachées aux microporteurs.

Figure 4.Comptage de cellules et détermination de viabilité de cellules sur microporteurs L’ajout des
L’ajout des réactifs A100 et B lyse les cellules ainsi les noyaux sont en suspension (A). Le nombre total de cellules sera coloré en bleu avec le DAPI et peut être détecté par le NC-200™ (B). Le logiciel NucleoView™ permet à l’utilisateur de vérifier que les cellules ont été comptées correctement (C).

Note d’application (.PDF):
Viabilité et comptage de cellules avec les réactifs A100 et B

Comptage précis de cellules souches issues de tissu adipeux

Les cellules souches issues de tissu adipeux (CSA) et les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la fraction stromale vasculaire (FSV) sont d’un grand intérêt. Ces cellules souches multipotentes sont facilement accessibles et peuvent être purifiées en nombres suffisants directementà partir de tissu adipeux. La détermination de comptage de cellules et de viabilité de CSA directement de FSV est surtout compliquée. En comptant manuellement ou avec certains compteurs automatiques, les micelles et les micros vésicules peuvent facilement être confondus avec des cellules et ainsi fausser le résultat. Le NucleoCounter^® NC-200™ compte uniquement les cellules nucléées qui survivent à ce défi (figure 3). Avec l’ajout du tampon de lyse, les cellules et autres particules à membranes seront lysées, ce qui laisse seulement les noyaux libres en suspension pour être colorés et comptés avec le DAPI et le NucleoCounter^® NC-200™.

Figure 5. Détermination de comptage de cellules de cellules souches mésenchymateuses issues de tissu adipeux (CSM).
Des CSM issues de fraction stromale vasculaire contiendront un mélange de cellules, micelles, liposomes et micros vésicules (A). En utilisant la Solution 10, ces particules seront dissoutes et les membranes seront perméabilisées permettant la coloration des noyaux. La cytométrie d’image de cellules colorées avec le DAPI (B) montre uniquement les cellules nucléées. Le logiciel accompagnant NucleoView™ pour le NucleoCounter^® NC-200™ permet une identification facile des cellules comptées (C).

Note d’application (.PDF):
Viabilité et comptage de cellules – Test de cellules agrégées mammifères

Le comptage de cellules mononuclées de sang périphérique (CMSP) dans des échantillons de sang total

Les cellules mononuclées de sang périphérique sont des cellules avec un noyau rond. Les CMSP sont des composants critiques du système immunitaire et sont ainsi d’un grand intérêt dans les domaines versatiles biologiques de recherche. Les méthodes standards pour séparer et évaluer le contenu de CMSP dans un échantillon de cellules incluent une séparation Ficoll suivi par un comptage et une détermination de viabilité du nombre de CMSP dans l’échantillon. La détermination du comptage de cellules et de la viabilité de CMSP peut être effectuée directement de l’échantillon de sang sans passer du temps à purifier.
Avec le NucleoCounters^® NC-200™, NC-250™ and NC-3000™, la viabilité et le comptage de cellules total de leucocytes peuvent être facilement déterminé dans des échantillons contenant des plaquettes et des cellules sanguines rouges (Figure 6).
En ajoutant la Solution 17, les cellules sanguines rouges sont lysées et l’hémoglobine est diluée, ce qui laisse uniquement les cellules nucléées pour être colorées avec l’orange acridine (vert) et le DAPI (bleu). Les plaquettes ne seront pas comptées parce qu’elles seront colorées faiblement. La cytométrie d’image avec les instruments de la famille NucleoCounter^® NC-200™, NC-250™ ou NC-3000™ permet une détermination de viabilité et de comptage de cellules rapide, précis et facile de leucocytes directement dans des échantillons de sang périphérique.

Comptage de cellules et détermination de leucocytes directement d’échantillon de sang. Le sang contient un mélange de cellules sanguines rouges, de plaquettes et de leucocytes (A). BEn utilisant la solution 17, les cellules sanguines rouges seront lysées, ce qui laisse seulement les leucocytes pour être colorés avec l’orange acridine pour le total de cellules (vert) et le DAPI pour les cellules inviables (bleu). Les plaquettes ne pourront pas être comptées à cause de la coloration très faible. La cytométrie d’image de cellules colorées (B) montre les leucocytes (vert) et les leucocytes inviables (vert et bleu). Le logiciel accompagnant NucleoView™ permet une identification facile de cellules comptées (C).

Note d’application (.PDF):
Test de sang total - Viabilité et comptage de cellules

Validation GMP et prêt 21 CFR partie 11

Le NucleoCounter^® NC-200™ est conçu pour être facilement mis en œuvre dans des laboratoires conformes à la GMP et 21 CFR partie 11. Les protocoles intégrés pour IQ/OQ/PQ assurent une opération cohérente. Des rapports PDF standardisés, le contrôle d’utilisateur et les pistes d’audit permettent une documentation des évènements. Avec la grande reproductibilité et la cohérence des mesures, le NucleoCounter^® NC-200™ est le choix idéal pour le comptage de cellules automatique dans des laboratoires conformes à la GMP et 21 CFR partie 11.

Papier blanc (.PDF):
GMP et 21 CFR partie 11 - NC200™