Comptage des PBMC du sang
Avec les NucleoCounter®
La concentration des cellules nucléées dans le sang est un paramètre essentiel en immunologie. Les NucleoCounter® sont des instruments rapides, efficaces et peu couteux offrant une alternative aux méthodes de comptage classiques utilisés en hématologie. Le comptage est réalisé directement à partir d’un prélèvement sanguin à l’aide d’un tampon de lyse spécifique des globules rouges et grâce à un double marquage en fluorescence pour obtenir simultanément le nombre de cellules et leur viabilité. L’analyse elle-même se fait en 1 minutes et ne nécessite ni préchauffage, ni calibration, ni Ficoll. Le NucleoCounter® est donc un instrument idéal pour la recherche et les laboratoires de BioProcessing évitant de nombreuses étapes de préparation et nécessitant un faible volume d’échantillon. Enfin, et contrairement aux autres analyseurs utilisés en hématologie, le NucleoCounter® peut être utilisé pour de nombreux autres tests fréquemment utilisés en culture cellulaire, et ce, avec une grande précision.
Dénombrement (+ viabilité) rapide et facile des cellules nucléées du sang
Figure 1: Dénombrement (+ viabilité) rapide et facile des cellules nucléées du sang. Incuber la préparation sanguine avec la solution 17 puis ajouter directement dans la Via1-CassetteTM ou la NC-SlideTM pour une analyse sur le NucleoCounter®
Les analyseurs utilisés en hématologie pour caractériser les cellules sanguines sont à la fois couteux et complexes. A l’inverse, le NucleoCounter® propose un protocole rapide et facile pour déterminer précisément le nombre de cellules (avec leur viabilité) directement à partir d’un échantillon sanguin. L’ajout de la solution 17 à l’échantillon sanguin suivi d’une incubation rapide à 37°C provoque la lyse des érythrocytes pour permettre l’analyse sur le NucleoCounter® avec la Via1-CassetteTM ou les NC-SlidesTM (Figure 1). Le NucleoComptage est rapide, bon marché et peut être utilisé pour d’autres applications en immunothérapie adaptative ou pour le dénombrement de cellules souches mésenchymateuses issues de la moelle osseuse.
Comptage des cellules nucléées du sang
Figure 2. L’hémoglobine des érythrocytes interfère avec le signal en fluorescence utilisé avec par le NC. En ajoutant la solution 17 – un tampon contenant du chlorure d’ammonium – à l’échantillon puis en incubant quelques minutes, seules les globules rouges seront lysées tout en permettant un marquage des cellules nucléées à l’acridine orange (cellules totales) et au DAPI (cellules mortes). Après cette étape, les cellules nucléées sont détectables au NC et peuvent ainsi être dénombrées.
L’échantillon sanguin est directement mélangé à la solution 17, un tampon contenant du chlorure d’ammonium, afin de lyser les érythrocytes par pression osmotique tout en augmentant la concentration en acridine orange pour compenser le quenching du à l’hémoglobine. Après une courte incubation, ce mélange est marqué à l’acridine orange et au DAPI dans la Via1-Cassette™ et chargé dans le NucleoCounter® NC-200™ (Figure 2).
L’acridine orange va marquer toutes la population cellulaire tandis que le DAPI va uniquement colorer les cellules mortes. Afin de dénombrer les cellules et évaluer leur viabilité, le NC-200™ va effectuer une acquisition en fluorescence et dénombrer les 2 types de signaux. Le logiciel associé NucleoView™ va permettre un couplage des 2 images en fluorescence (acridine orange + DAPI) et génèrera des graphes de type cytométrie pour une analyse quantitative et précise des évènements cellulaires.
Note technique (.PDF):
Dénombrement des cellules nucléées dans le sang : des enjeux thérapeutiques importants
Les échantillons sanguins sont souvent utilisés comme matériel de départ en biologie ou en thérapie cellulaire. Ils contiennent un mélange de différents types cellulaires : lymphocytes, monocytes, granulocytes, cellules souches hématopoïétiques, érythrocytes ou plaquettes. La fraction des cellules nucléées représente un enjeu important pour les scientifiques travaillant sur les transplantations, en vaccinologie, en développement d’essais cliniques, en immunologie, ou en cancérologie.
Puisque les procédures de purification de ces différentes sous-populations sanguines sont à la fois onéreuses et longues, le NucleoCounter® offre l’opportunité de dénombrer rapidement et simplement l’ensemble de cette population cellulaire préalablement ou durant l’isolement de ces cellules. Le NucleoCounter® permet également d’évaluer la qualité des échantillons sanguins après expédition ou stockage de même qu’il permet d’effectuer des tests de routine en pré-clinique sur des modèles animaux voire des comptages cellulaires directement sur des prélèvements de moelle osseuse.
Bibliographie
- Zhang, M. and B. Huang, The multi-differentiation potential of peripheral blood mononuclear cells. Stem Cell Research & Therapy, 2012. 3(6): p. 48-48.
- Park, B., K.H. Yoo, and C. Kim, Hematopoietic stem cell expansion and generation: the ways to make a breakthrough. Blood research, 2015. 50(4): p. 194-203.
- Crippen TL, et al., Analysis of salmonid leukocytes purified by hypotonic lysis of erythrocytes. Journal of Aquatic Animal Health, 2001. 13: p. 234-245.
Suivez nous