Comptage des cellules agrégées
– avec le NucleoCounter®
Le NucleoCounter utilise des marqueurs fluorescents pour colorer les noyaux cellulaires
La microscopie optique permet de mettre en évidence le contour des objets en fonction de leur teinte (figure 1). Le comptage des cellules à l’aide des méthodes classiques de microscopie optique peut entraîner l’inclusion de contaminations et de débris cellulaires visuellement impossibles à distinguer des cellules. Plus important encore, lorsque le contour extérieur des cellules adjacentes se chevauche, comme dans le cas des amas cellulaires, il peut être presque impossible d’identifier avec précision les cellules individuelles.
Les instruments NucleoCounter® utilisent l’Acridine Orange et le DAPI – deux colorants fluorescents ayant une affinité pour l’ADN – pour marquer les noyaux cellulaires avec une grande spécificité et générer des signaux à fort contraste. Les noyaux, plus petits que les cellules entières, sont plus faciles à segmenter lorsque les cellules forment de petits agrégats (figure 1). De plus, certains artefacts qui seraient visibles au microscope optique deviennent indétectables au microscope à fluorescence.
Figure 1: La microscopie optique versus la microscopie en fluorescence pour dénombrer les cellules agrégées. Les artéfacts visibles en microscopie optique ne sont pas visibles avec des filtres fluorescents. De plus, les noyaux marqués à l’acridine orange présentent un signal plus facile à analyser de façon automatisée ce qui permet une meilleure identification des cellules dans l’agrégat. Sur cette image, une acquisition en a été réalisé avec un système de microscopie propriétaire configuré pour de la microscopie optique de même qu’avec des filtres fluorescents.
Le logiciel NC-View™ est capable de distinguer les cellules au sein de petits agrégats
NC-View™ est la partie logicielle du système NucleoCounter® NC-202™. Il utilise un algorithme puissant pour identifier et analyser avec précision les cellules individuelles au sein d’agrégats plus petits. Les pics d’intensité et les pentes correspondantes sont utilisés pour segmenter les objets par rapport aux niveaux d’intensité de fond. Les cellules qui sont proches les unes des autres présentent toujours des pics discrets identifiables, même si leurs pentes correspondantes peuvent se chevaucher (figure 2).
Figure 2 : Analyse d’image automatisée avec le logiciel NC-View™. Les images acquises avec l’instrument NucleoCounter® sont instantanément traitées avec le logiciel NC-View™. Les pics de signaux en fluorescence ainsi que leur surface sont utilisés pour distinguer individuellement chaque cellule. La segmentation des cellules vivantes et mortes (vert et rouge respectivement) est superposée aux tracés de l’image pour faciliter le traitement de validation par l’utilisateur.
Le NucleoCounters® donne une estimation du pourcentage d’agrégation des cellules
Compter les cellules fortement agrégées avec le NucleoCounter®
Certains types cellulaires (HEK, MCF-7, HepG2, iPSC, etc.), les cellules cultivées dans des sphères ou sur microporteurs et les échantillons de tissus auront tendance à former de grands amas qui résistent aux méthodes de séparation enzymatique ou mécanique. Les cellules individuelles de ces grands agrégats auront tendance à se superposer, ce qui réduit l’exactitude et la précision du comptage cellulaire. Le NC-View™ indiquera le pourcentage de cellules dans les agrégats de plus de cinq cellules afin de signaler les échantillons où l’agrégation des cellules pourrait affecter le comptage cellulaire. Un protocole dédié aux cellules agrégrées est recommandé pour de tels échantillons. Dans le protocole d’analyse des cellules agrégées, le nombre total de cellules provient d’une aliquote séparée de l’échantillon (figure 3). Le processus de lyse perturbe la membrane cellulaire, démantelant les amas et libérant les noyaux à colorer dans la solution. Etant donné que les cellules mortes sont généralement moins abondantes et ont tendance à se détacher des agrégats, le comptage des cellules mortes peut toujours être basé sur l’aliquote non lysée (figure 3).
Représentation schématique du protocole « Aggregated Cells »
Suivez nous