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Comptage de cellules souches mésenchymateuses

Comptage de cellules souches mésenchymateuses

En médecine régénérative

NucleoCounter®propose une méthode robuste et précise pour déterminer le nombre de cellule et la viabilité de MSC provenant de différentes sources (lipoaspirations et ponctions de moelle osseuse). Le prélèvement de l’échantillon, le marquage et le chargement dans la chambre de mesure sont assurés par un élément unique : la Via1-Cassette™ et ce en une seule étape pour assurer homogénéité et robustesse des mesures entre les différents utilisateurs. Grâce à sa simplicité opérationnelle, cet équipement convient donc parfaitement aux centres de recherche fonctionnant en conditions GMP.

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L’importance des cellules souches mésenchymarteuses dans la médecine régénérative

Les MSC sont obtenues à partir de ponction de moelle osseuse, de liposuccions ou de sang de cordon, du placenta ou la gelée de Wharton. Elles sont utilisées pour traiter différentes pathologies, principalement osseuses, cardiaques, musculosquelettiques ou hématologiques. Ces cellules peuvent être générées à partir d’un patient traité (autologue) ou d’un donneur (allogénique). L’étude des MSC n’a donc cessé d’être un domaine en en perpétuelle évolution dès la découverte que ces cellules pouvaient se différencier en cellules osseuses, en cellules adipeuses, en cartilage, en muscle ou en neurones1-3. Elles représentent donc des candidats de choix pour la médecine régénérative. Les applications cliniques potentielles des MSC vont de la transplantation jusqu’à la régénération de tissus4, 5 voire le traitement de maladies liées au système immunitaire6 comme le rejet de greffe. Enfin, les MSC sécrètent des facteurs anti-apoptotiques, des cytokines angiogéniques et des facteurs de croissance qui améliorent le processus de guérison après infarctus du myocarde7 ou la cicatrisation8 (Figure 1).

Counting of Mesenchymal Stem Cells using NucleoCounter instruments

Figure 1. MSC dans les thérapies allogéniques ou autologues. les cellules souches mésenchymateuses peuvent être isolées à partir de la fraction vasculaire stromale (SVF) après liposuccion ou à partir de ponction de moelle osseuse. Ces MSC peuvent directement être cultivées puis être stockées à long terme pour la thérapie autologue ou allogénique. Durant toutes ces phases de production, le comptage et la viabilité peuvent être mesurés avec fiabilité par les  ®.

Comptage précis de cellules souches dérivées d’adipocytes après lipoaspirations

Les MSC dérivés d’adipocytes sont des cellules très prolifératives et peuvent être facilement isolées à partir de la fraction vasculaire stromale (SVF) après biopsies ou liposuccions9-11. Cette fraction reste assez hétérogène en terme de types cellulaires (cellules souches mésenchymateuses, endothéliales, stromales, adipocytes, sanguines ainsi que des micelles et gouttelette lipidiques12). Pour les applications en thérapie cellulaire, les SVF peuvent être directement utilisés chez le patient. Mais il est crucial de quantifier précisément le nombre total de cellules avec leur viabilité pour les étapes en aval (mise en culture). Hormis celles impliquant le NucleoCounter, aucune des techniques de comptage ne permet de distinguer les cellules des artefacts (micelles, gouttelettes lipidiques, débris) et ces techniques de comptage sont en outre sujets à des variations importantes entre opérateurs. Pour solutionner ce problème, les  NucleoCounter® proposent un outil très efficace permettant de déterminer le nombre total de cellules ainsi que leur viabilité dans des extraits contenant des MSC13-18.

Pour dénombrer les cellules dans la SVF avec les NucleoCounter®, , la suspension cellulaire est traitée avec la Solution 10 (voire les réactifs A100 and B) afin de lyser toutes les membranes plasmiques et ne colorer en DAPI que les noyaux grâce à la Via1-Cassette™ (Figure 2). De par la haute spécificité du DAPI pour l’ADN, les NucleoCounter® vont dénombrer uniquement les cellules contenant un noyau et ainsi éviter de compter les autres éléments biologiques contenues dans cette suspension brute, tels que les débris, les micelles, les microvésicules, les corps gras ou les cellules sans ADN comme les érythrocytes ou les plaquettes.

Accurate counting of adipose-derived MSCs in Lipoaspirates

Figure 2. Comptage cellulaire précis avec viabilité dans la fraction vasculaire stromale (SVF). Outre les différents types cellulaires, la SVF contient d’autres éléments biologiques tels que des micelles, des corps gras, des érythrocytes et des microvésicules qui compromettent la mesure. L’ajout de la Solution 10 (voire des réactifs A100 and B) va induire une lyse des membranes plasmiques conduisant au relargage des noyaux qui se retrouveront en suspension. Ces derniers seront colorés au DAPI et détectés par le  NucleoCounter® pour déterminer le nombre total de cellules. Dans une 2nde étape, la concentration de cellules mortes sera déterminé également au DAPI mais avec ce même échantillon non traité.

 

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Comptage précis des cellules souches mésenchymateuses issues de la moelle osseuse

Les  MSC sont obtenues à partir de biopsies de moelle osseuse ou de lipoaspirations19, 20. Le comptage cellulaire ainsi que la viabilité de ces MSC au sein de ces extraits très hétérogènes est extrêmement difficile du fait de la présence d’un grand nombre d’érythrocytes qui ne doivent pas être inclus dans le comptage. Afin de dénombrer de façon fiable, rapide et facile les MSC dans ces ponctions de moelle osseuse21, 22 les NucleoCounter® représentent les outils les plus adaptés puisque, comme leur nom l’indique, ils ne dénombrent que les cellules nucléées (Figure 3). Après ajour d’un tampon qui va spécifiquement lyser les hématies tout en diluant l’hémoglobine, les globules blancs (intègres) seront marqués à l’acridine orange et au DAPI pour les dénombrer et mesurer leur viabilité.

Precise counting of bone marrow-derived MSCs

Figure 3: Comptage facile, rapide et reproductible des cellules nucléées dans un extrait de ponction de moelle osseuse. L’ajout de la Solution 17 à l’échantillon suivi d’une courte incubation (5 min) va permettre de lyser les hématies et de marquer les cellules nucléées à l’acridine orange (cellules totales) et au DAPI (cellules mortes) qui seront ainsi prêtes à être analysées avec les  NucleoCounter® .

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Gestion des données et intégration dans des environnements GMP

Le logiciel intuitif NucleoView™ va automatiquement renvoyer la concentration cellulaire (totales et vivantes) ainsi que la viabilité. Il permet également d’inspecter visuellement le comptage sur l’image en fluorescence. Les NucleoCounter® peuvent être utilisés dans des laboratoires GMP en accord avec la réglementation 21 CFR part 11 (Figure 4). La facilité d’utilisation, la calibration du volume et la pipette intégrée de la  Via1-Cassette™ assure un prélèvement standardisé et homogène tout en s’affranchissant des variations inter-opérateurs pour garantir des mesures hautement reproductibles.

GMP ready Automated Cell CounterFigure 4. Le NucleoCounter® NC-200TM en mode 21 CFR part 11. Outre la possibilité de qualifier régulièrement l’instrument (QI, QO, QP), le mode 21 CFR part 11 permet de gérer les enregistrements et signatures électroniques. Et grâce à un consommable calibré et des protocoles adaptés et spécifiques, les mesures de concentration cellulaire et de viabilité sont fiables et reproductibles. 

Application Note (.PDF):

Literature

  1. Dominici, M., et al., Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006. 8(4): p. 315-317.
  2. Makino, S., et al., Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. Journal of Clinical Investigation, 1999. 103(5): p. 697-705.
  3. Arthur, A., et al., Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells, 2008. 26(7): p. 1787-1795.
  4. Horwitz, E.M., et al., Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: implications for cell therapy of bone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002. 99(13): p. 8932-8937.
  5. Kawada, H., et al., Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Blood, 2004. 104(12): p. 3581-3587.
  6. Zhao, K., et al., Immunomodulation effects of mesenchymal stromal cells on acute graft-versus-host disease after hematopoietic stem cell transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation, 2015. 21(1): p. 97-104.
  7. Hahn, J.-Y., et al., Pre-treatment of mesenchymal stem cells with a combination of growth factors enhances gap junction formation, cytoprotective effect on cardiomyocytes and therapeutic efficacy for myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology, 2008. 51(9): p. 933-943.
  8. Schnabel, L.V., et al., Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research, 2009. 27(10): p. 1392-1398.
  9. Zuk, P.A., et al., Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell, 2002. 13(12): p. 4279-4295.
  10. Mizuno, H., M. Tobita, and A.C. Uysal, Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells, 2012. 30(5): p. 804-810.
  11. Gimble, J.M., A.J. Katz, and B.A. Bunnell, Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research, 2007. 100(9): p. 1249-1260.
  12. Astori, G., et al., “In vitro” and multicolor phenotypic characterization of cell subpopulations identified in fresh human adipose tissue stromal vascular fraction and in the derived mesenchymal stem cells. Journal of Translational Medicine, 2007. 5: p. 55-55.
  13. Kølle, S.-F.T., et al., Enrichment of autologous fat grafts with ex-vivo expanded adipose tissue-derived stem cells for graft survival: a randomised placebo-controlled trial. The Lancet, 2013. 382(9898): p. 1113-1120.
  14. Araña, M., et al., Preparation and characterization of collagen-based ADSC-carrier sheets for cardiovascular application. Acta Biomaterialia, 2013. 9(4): p. 6075-6083.
  15. Kazantseva, J., et al., Alternative splicing targeting the hTAF4-TAFH domain of TAF4 represses proliferation and accelerates chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. PLoS ONE, 2013. 8(10): p. e74799.
  16. Choi, J.S., et al., In vitro expansion of human adipose-derived stem cells in a spinner culture system using human extracellular matrix powders. Cell and Tissue Research, 2011. 345(3): p. 415-423.
  17. Suga, H., et al., IFATS collection: Fibroblast growth factor-2-induced hepatocyte growth factor secretion by adipose-derived stromal cells inhibits postinjury fibrogenesis through a c-Jun N-terminal kinase-dependent mechanism. Stem Cells, 2009. 27(1): p. 238-249.
  18. Miyazaki, T., et al., Isolation of two human fibroblastic cell populations with multiple but distinct potential of mesenchymal differentiation by ceiling culture of mature fat cells from subcutaneous adipose tissue. Differentiation, 2005. 73(2): p. 69-78.
  19. Meirelles, L.d.S., P.C. Chagastelles, and N.B. Nardi, Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. Journal of Cell Science, 2006. 119(11): p. 2204-2213.
  20. Kuznetsov, S.A., et al., Circulating skeletal stem cells. The Journal of Cell Biology, 2001. 153(5): p. 1133-1140.
  21. Heathman, T.R.J., et al., Expansion, harvest and cryopreservation of human mesenchymal stem cells in a serum-free microcarrier process. Biotechnology and Bioengineering, 2015. 112(8): p. 1696-1707.
  22. Heathman, T.R.J., et al., Serum-free process development: improving the yield and consistency of human mesenchymal stromal cell production. Cytotherapy, 2015. 17(11): p. 1524-1535.

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