Les MSC dérivés d’adipocytes sont des cellules très prolifératives et peuvent être facilement isolées à partir de la fraction vasculaire stromale (SVF) après biopsies ou liposuccions^9-11. Cette fraction reste assez hétérogène en terme de types cellulaires (cellules souches mésenchymateuses, endothéliales, stromales, adipocytes, sanguines ainsi que des micelles et gouttelette lipidiques¹²). Pour les applications en thérapie cellulaire, les SVF peuvent être directement utilisés chez le patient. Mais il est crucial de quantifier précisément le nombre total de cellules avec leur viabilité pour les étapes en aval (mise en culture). Hormis celles impliquant le NucleoCounter, aucune des techniques de comptage ne permet de distinguer les cellules des artefacts (micelles, gouttelettes lipidiques, débris) et ces techniques de comptage sont en outre sujets à des variations importantes entre opérateurs. Pour solutionner ce problème, les  NucleoCounter^® proposent un outil très efficace permettant de déterminer le nombre total de cellules ainsi que leur viabilité dans des extraits contenant des MSC^13-18.

Pour dénombrer les cellules dans la SVF avec les NucleoCounter^®, , la suspension cellulaire est traitée avec la Solution 10 (voire les réactifs A100 and B) afin de lyser toutes les membranes plasmiques et ne colorer en DAPI que les noyaux grâce à la Via1-Cassette™ (Figure 2). De par la haute spécificité du DAPI pour l’ADN, les NucleoCounter^® vont dénombrer uniquement les cellules contenant un noyau et ainsi éviter de compter les autres éléments biologiques contenues dans cette suspension brute, tels que les débris, les micelles, les microvésicules, les corps gras ou les cellules sans ADN comme les érythrocytes ou les plaquettes.

Figure 2. Comptage cellulaire précis avec viabilité dans la fraction vasculaire stromale (SVF). Outre les différents types cellulaires, la SVF contient d’autres éléments biologiques tels que des micelles, des corps gras, des érythrocytes et des microvésicules qui compromettent la mesure. L’ajout de la Solution 10 (voire des réactifs A100 and B) va induire une lyse des membranes plasmiques conduisant au relargage des noyaux qui se retrouveront en suspension. Ces derniers seront colorés au DAPI et détectés par le  NucleoCounter^® pour déterminer le nombre total de cellules. Dans une 2nde étape, la concentration de cellules mortes sera déterminé également au DAPI mais avec ce même échantillon non traité.

Les  MSC sont obtenues à partir de biopsies de moelle osseuse ou de lipoaspirations^{19, 20}. Le comptage cellulaire ainsi que la viabilité de ces MSC au sein de ces extraits très hétérogènes est extrêmement difficile du fait de la présence d’un grand nombre d’érythrocytes qui ne doivent pas être inclus dans le comptage. Afin de dénombrer de façon fiable, rapide et facile les MSC dans ces ponctions de moelle osseuse^{21, 22} les NucleoCounter^® représentent les outils les plus adaptés puisque, comme leur nom l’indique, ils ne dénombrent que les cellules nucléées (Figure 3). Après ajour d’un tampon qui va spécifiquement lyser les hématies tout en diluant l’hémoglobine, les globules blancs (intègres) seront marqués à l’acridine orange et au DAPI pour les dénombrer et mesurer leur viabilité.

Figure 3: Comptage facile, rapide et reproductible des cellules nucléées dans un extrait de ponction de moelle osseuse. L’ajout de la Solution 17 à l’échantillon suivi d’une courte incubation (5 min) va permettre de lyser les hématies et de marquer les cellules nucléées à l’acridine orange (cellules totales) et au DAPI (cellules mortes) qui seront ainsi prêtes à être analysées avec les  NucleoCounter^® .

Le logiciel intuitif NucleoView™ va automatiquement renvoyer la concentration cellulaire (totales et vivantes) ainsi que la viabilité. Il permet également d’inspecter visuellement le comptage sur l’image en fluorescence. Les NucleoCounter^® peuvent être utilisés dans des laboratoires GMP en accord avec la réglementation 21 CFR part 11 (Figure 4). La facilité d’utilisation, la calibration du volume et la pipette intégrée de la  Via1-Cassette™ assure un prélèvement standardisé et homogène tout en s’affranchissant des variations inter-opérateurs pour garantir des mesures hautement reproductibles.

Figure 4. Le NucleoCounter^® NC-200^TM en mode 21 CFR part 11. Outre la possibilité de qualifier régulièrement l’instrument (QI, QO, QP), le mode 21 CFR part 11 permet de gérer les enregistrements et signatures électroniques. Et grâce à un consommable calibré et des protocoles adaptés et spécifiques, les mesures de concentration cellulaire et de viabilité sont fiables et reproductibles. 

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