Comment fonctionnent les compteurs de cellules automatisés ?

L’importance des compteurs de cellules automatisés

L’industrie pharmaceutique est connue pour adopter une approche réfléchie vis-à-vis des nouvelles technologies. Cependant, avec l’avènement de la Pharma 4.0, les leaders de l’industrie testent et déploient rapidement de nouvelles solutions automatisées.

La clé de ce changement de paradigme est la Technologie d’Analyse des Procédés (PAT).

La PAT consiste à comprendre et à contrôler le processus de fabrication en temps réel pour garantir une qualité optimale. Cette approche permet une analyse plus rapide et plus efficace des processus de fabrication. Le résultat de la PAT est de soutenir l’approche Qualité par la Conception (QbD) de la fabrication de médicaments. Le QbD vise à adopter une approche du « bon du premier coup » afin de garantir la qualité du produit pharmaceutique fini. Les avantages de cette approche sont nombreux, notamment des délais plus courts et des médicaments plus sûrs.

Les résultats des approches automatisées et PAT pour la fabrication de produits biopharmaceutiques incluent une meilleure :

• qualité et rendement du produit pharmaceutique
• compréhension et contrôle du processus
• reproductibilité.

Actuellement, plus de trois mille thérapies cellulaires et géniques sont en développement. Pour ces thérapies et d’autres médicaments à base de cellules (par exemple, les vaccins et les produits biologiques), les variations du nombre de cellules et de leur viabilité lors des différentes étapes du processus de fabrication peuvent entraîner une qualité et un rendement médiocres du produit. Des produits tels que la bière et le vin nécessitent également des concentrations précises de levures pour optimiser le goût et la qualité.

Les compteurs de cellules automatisés aident à suivre ces caractéristiques de manière fiable. De plus, ils peuvent aider à obtenir un avantage dans la course pour amener les produits à la clinique ou sur le marché le plus rapidement possible. Réduire les temps d’arrêt et éviter les goulots d’étranglement est un objectif commun aux entreprises pharmaceutiques. L’amélioration de la qualité et de la compréhension des processus profite également aux patients en contribuant à la création de produits plus sûrs.

Les compteurs de cellules automatisés améliorent la précision du dénombrement cellulaire. Cependant, ils ont certaines sources courantes de variabilité. Les plus courantes ? La variation entre les instruments, la variation dans la préparation des échantillons et les variations entre les utilisateurs.

Explorons maintenant ce qui distingue les compteurs de cellules automatisés des méthodes semi-automatisées et manuelles.

Qu’est-ce que les compteurs de cellules automatisés ?

Les compteurs de cellules automatisés sont des instruments d’analyse qui quantifient le nombre de cellules dans un échantillon, avec une intervention humaine minimale.

En plus du décompte cellulaire, ils mesurent souvent la taille des cellules et calculent leur viabilité. Un objectif commun parmi les compteurs de cellules automatisés est de réduire le biais humain dans le processus. Cela a le potentiel de rendre la recherche plus reproductible, la fabrication mieux contrôlée et les produits plus sûrs.

Les compteurs de cellules automatisés s’appuient sur un logiciel pour analyser les cellules. Les données qu’ils fournissent peuvent également être facilement exportées pour une analyse ultérieure. Certains compteurs de cellules automatisés ont des fonctionnalités supplémentaires qui garantissent la conformité avec la partie 11 du titre 21 du Code of Federal Regulations (21 CFR part 11) et les bonnes pratiques de fabrication en vigueur (cGMP).

Malgré leur caractère « automatisé », de nombreux compteurs de cellules automatisés nécessiteront quelques étapes manuelles. Toutefois, l’objectif d’un compteur de cellules automatisé devrait être d’éliminer autant d’étapes manuelles que possible. Ces considérations seront discutées plus en détail ci-dessous. Types de compteurs de cellules automatisés Il existe trois catégories de compteurs de cellules automatisés :

• Les compteurs de cellules basés sur l’impédance électrique
• Les cytomètres en flux
• Les cytomètres d’image

Les trois types sont disponibles aujourd’hui, produits par une gamme de fabricants. Certains instruments peuvent convenir davantage à l’académie, tandis que d’autres peuvent être conçus pour la fabrication cGMP de médicaments humains. D’autres peuvent être plus adaptés en tant qu’outils de mesure en ligne, tandis que d’autres peuvent être d’excellents outils en ligne ou hors ligne. Le bon compteur de cellules pour un processus peut ne pas être le compteur de cellules préféré pour un autre.

Les considérations sur le meilleur type de compteur de cellules automatisé pour vous dépendent des coûts totaux, des performances et de la commodité.

Types of Automated Cell Counters

There are three categories of automated cell counters:

1. Electrical impedance-based cell counters
2. Flow cytometers
3. Image cytometers

All three types are available for use today, produced by a range of manufacturers. Some instruments may be a better fit for academia, whereas others may be designed for cGMP manufacturing of human medicines.

Others may be a better fit as an on-line measurement tool, whereas others may be great at-line or off-line tools. The right cell counter for one process may not be the preferred cell counter for another.

Considerations on which type of automated cell counter is best for you depend on total costs, performance and convenience.

Principes des compteurs de cellules automatisés

Impédance électrique

Les compteurs de cellules basés sur l’impédance électrique utilisent le principe du courant électrique pour compter les cellules.

L’idée est que les particules auront une conductivité différente de celle d’une solution électrolytique environnante.

Ces instruments font passer les cellules en suspension dans une solution électrolytique à travers une ouverture étroite. Cette ouverture est entourée de deux électrodes. Les cellules passent une par une à travers l’ouverture, et au fur et à mesure, les électrodes détectent un changement (ou une impédance) dans la conductivité électrique. Chaque fois que l’ impédance se produit, cela est compté, déterminant ainsi le nombre de cellules.

Cette technologie a été utilisée pour développer une large gamme de compteurs et d’analyseurs de cellules depuis les années 1950.3 Un avantage majeur est qu’ils ne nécessitent pas de coloration de l’échantillon cellulaire.

Cependant, ces appareils présentent des causes d’erreur communes. La principale est que les particules sont comptées lorsqu’elles passent à travers l’ouverture. Parfois, plusieurs particules peuvent passer simultanément, ce que l’on appelle un événement de coïncidence.4 De même, les particules peuvent refluer à travers l’ouverture et être comptées deux fois.

Modifier la taille de l’ouverture ou diluer l’échantillon cellulaire sont les moyens habituels de résoudre ces problèmes.

Les instruments basés sur l’impédance électrique ne sont pas spécifiques aux cellules et sont parfois appelés des analyseurs de particules. Par conséquent, les machines nécessitent des cellules en suspension exemptes de contamination pour fournir des comptages précis. Ces instruments sont excellents pour mesurer la taille des cellules, car la taille de la cellule est directement proportionnelle à l’impédance électrique observée.

Cytomètres en flux

Les cytomètres en flux mesurent les caractéristiques optiques et fluorescentes des cellules grâce au principe de la diffusion de la lumière. Ces machines sont composées d’un système fluidique, d’un système optique et d’électronique.

Les cellules en suspension s’écoulent une par une dans un courant de fluide avant de rencontrer la lumière laser. À partir de là, la lumière se diffuse dans différentes directions en fonction des caractéristiques intrinsèques et extrinsèques de la cellule.

La lumière est collectée, convertie en données par l’ordinateur et visualisée.

La lumière peut se diffuser vers l’avant ou sur les côtés. La lumière diffusée vers l’avant est utilisée pour déterminer la taille et la viabilité des cellules et distinguer les débris des cellules vivantes. La lumière qui se diffuse sur les côtés nous renseigne sur les caractéristiques internes de la cellule.

La cytométrie en flux permet le comptage des cellules ainsi que l’analyse des organites, des marqueurs de surface cellulaire et du contenu en acide nucléique ou en protéines.

La cytométrie en flux est à la base du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), qui permet de trier les cellules en fonction des marqueurs fluorescents.

En ce qui concerne le comptage des cellules, les cytomètres en flux sont précis et peuvent analyser des échantillons de cellules hétérogènes et des cellules rares à un rythme élevé.

Un inconvénient des cytomètres en flux est qu’ils nécessitent un nettoyage quotidien et une maintenance régulière de leurs systèmes fluidiques et optiques. Même en suivant correctement les protocoles de nettoyage, les cytomètres en flux se bouchent, ce qui nécessite des compétences spécialisées et peut augmenter les coûts opérationnels.

Les cytomètres en flux fournissent des données précieuses, aidant les scientifiques à comprendre comment les médicaments et les maladies affectent la santé des cellules.

Cytomètres d’image

Les compteurs de cellules basés sur l’imagerie, ou cytomètres d’image, utilisent des caméras numériques avancées, des microscopes et des algorithmes d’apprentissage automatique pour compter les cellules. L’échantillon cellulaire est chargé sur une lame ou une cassette, puis placé dans le cytomètre d’image. Le compteur de cellules automatisé prend ensuite plusieurs images des cellules et l’image est analysée par l’algorithme. Après le traitement de l’image, la machine fournit le décompte des cellules ainsi que la viabilité et la taille des cellules.

Pour que les cellules soient visualisées au microscope, elles doivent être colorées. Certaines utilisent du bleu de trypan, comme les hémocytomètres, tandis que d’autres utilisent une coloration fluorescente. Certains cytomètres d’image offrent à la fois des canaux en champ clair et en fluorescence.

Le bleu de trypan colore les cellules mortes en pénétrant leur membrane cellulaire poreuse. En raison de la coloration, les cellules vivantes et les cellules mortes ont un aspect différent au microscope. Cette méthode de coloration fonctionne bien sur de nombreux types de cellules. Cependant, elle ne fonctionne pas bien avec des types de cellules complexes. Par exemple, certains échantillons de cellules peuvent contenir des globules rouges (mammifères) qui ressemblent beaucoup à d’autres cellules mammifères au microscope.

La microscopie en fluorescence offre une solution dans cette situation. Des colorants fluorescents tels que l’acridine orange (AO) et le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) sont souvent utilisés ensemble pour distinguer respectivement les cellules viables des cellules mortes en colorant leurs noyaux. Les globules rouges humains ne contiennent pas de noyaux et ne seraient pas visibles lors de l’analyse effectuée par le compteur de cellules automatisé basé sur l’imagerie.

Il y a plusieurs avantages à utiliser des compteurs de cellules basés sur l’imagerie. L’un d’entre eux est qu’ils n’ont généralement pas de systèmes fluidiques étendus, ce qui réduit le besoin d’entretien. De plus, ils ont une empreinte réduite.

L’algorithme utilisé pour le comptage des cellules est particulièrement important en cytométrie d’image. La plupart des cytomètres d’image sont configurés avec plusieurs protocoles, chacun contenant des ajustements mineurs de l’algorithme. Cette flexibilité permet à l’utilisateur de choisir la meilleure approche pour l’échantillon cellulaire.

C’est l’un des avantages des compteurs de cellules basés sur l’imagerie. Les cytomètres d’image peuvent être programmés pour compter les cellules agrégées, par exemple. Un autre avantage est que vous pouvez voir les cellules vous-même dans le logiciel de l’instrument (soit sur un PC, soit sur l’écran du compteur de cellules s’il en possède un).

Cela donne plus de confiance dans le bon fonctionnement de l’algorithme. Un inconvénient de cette approche est que trop d’algorithmes peuvent compliquer le processus pour l’utilisateur.

Dans l’ensemble, les compteurs basés sur l’imagerie ont une empreinte réduite et améliorent l’efficacité du comptage des cellules.

Conclusion

Les compteurs de cellules automatisés résolvent les défis liés au comptage manuel des cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ils aident à fabriquer des médicaments plus sûrs et à surveiller les processus cellulaires. Cependant, leur utilisation peut nécessiter une manipulation manuelle des échantillons.

Dans la fabrication en cGMP et la biotransformation, les compteurs de cellules automatisés jouent un rôle essentiel dans la surveillance de la viabilité cellulaire, de la croissance cellulaire et de la concentration cellulaire, idéaux pour des processus tels que la fabrication de thérapies cellulaires et géniques. De nombreuses applications et industries bénéficient de compteurs de cellules automatisés fiables, et leur besoin devrait augmenter.

Lorsque vous envisagez l’achat d’un compteur de cellules automatisé, pensez à sa facilité d’utilisation et à ses performances. Testez-le sur divers échantillons cellulaires et faites des recherches, par exemple en lisant des articles comme celui-ci et en partageant avec vos collègues. Joyeux comptage des cellules !

Lectures complémentaires

• Mini-revues: Numération de cellules automatisée vs numération manuelle
• Journal: Le guide ultime des compteurs de cellules
• Journal: Comment compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre
• La gamme NucleoCounter®: Compteurs et analyseurs de cellules automatisés

Références

1. Office of Pharmaceutical Science in the Center for Drug Evaluation and Research (CDER). PAT — A Framework for Innovative Pharmaceutical Development, Manufacturing, and Quality Assurance. Available at: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/pat-framework-innovative-pharmaceutical-development-manufacturing-and-quality-assurance
2. Lohr, A. (2023). 2023’s market outlook for cell and gene therapies. Available at: https://www.cellandgene.com/doc/s-market-outlook-for-cell-and-gene-therapies-0001
3. Simson, E. (2013). Wallace Coulter’s life and his impact on the world. International Journal of Laboratory Hematology – Wiley Online Library. Available at: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/ijlh.12069
4. Wynn, E. J. W., & Hounslow, M. J. (1997). Coincidence correction for electrical-zone (Coulter-counter) particle size analysers. Powder Technology, 93(2), 163–175. https://doi.org/10.1016/S0032-5910(97)03267-1