Dévoiler les secrets : Comment compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre
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Un hémocytomètre (également appelé hématimètre ou chambre de comptage cellulaire) est un outil servant au comptage manuel des cellules. Comme son nom l’indique, l’hémocytomètre a été inventé à l’origine pour quantifier les cellules sanguines1. Aujourd’hui, les hémocytomètres sont utilisés pour déterminer le nombre total de cellules et la viabilité de nombreux types cellulaires différents dans diverses applications.
Dans cet article, nous répondrons aux questions courantes sur les hémocytomètres:
- Qu’est-ce que sont les hémocytomètres et comment fonctionnent-ils ?
- Comment compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ?
- Quelles règles et stratégies dois-je utiliser pour le comptage manuel de cellules ?
- Comment calculer le facteur de dilution, le nombre de cellules et leur viabilité ?
- À quelles erreurs courantes de comptage cellulaire dois-je faire attention ?
Que sont les hémocytomètres et comment fonctionnent-ils ?
Un hémocytomètres est une lame spéciale utilisée pour le comptage cellulaire. Il existe plusieurs types d’hémocytomètres avec des grilles de comptage différentes. Le plus couramment utilisé est la ’Chambre de comptage Neubauer améliorée’.
La chambre de comptage Neubauer améliorée
La chambre de comptage Neubauer améliorée a un quadrillage qui forme un H au centre de la lame qui sépare l’espace en deux chambres de comptage. Des grilles sont gravées sur la surface pour rendre le comptage cellulaire plus facile et plus précis.
La grille de comptage 3 × 3 mm est subdivisée en neuf carrés de 1 × 1 mm. Comme le montre le diagramme, chaque carré est ensuite subdivisé en 16, 100 ou 400 petits carrés. Les différentes grilles permettent de compter des cellules de différentes tailles.
Comment effectuer la numération de cellules à l’aide d’un hémocytomètre
Avant de commencer le comptage cellulaire à l’aide de votre hémocytomètre, il faut une certaine préparation. Commencez par prélever un échantillon représentatif de votre population cellulaire. Vous pouvez vérifier que votre échantillon est représentatif en remettant la solution en suspension en la pipetant plusieurs fois avant de prélever l’échantillon.
Si vous souhaitez déterminer la viabilité de vos cellules ainsi que leur nombre total, vous pouvez réaliser un test d’exclusion de colorant. Cela consiste à colorer vos cellules avec un colorant capable de différencier les cellules viables des cellules non-viables. Parmi les colorants les plus courants, nous avons le bleu de trypan, l’iodure de propidium, l’érythrosine B, l’orange d’acridine et le dichlorhydrate de diamidino-4′,6-phénylindole-2 (DAPI). Consultez notre article précédent pour en savoir plus sur ces colorants, leurs propriétés, avantages et inconvénients.
Vous pourriez avoir besoin de diluer vos cellules
Si votre chambre de comptage contient trop de cellules ou trop peu, cela aura un impact sur votre nombre de cellules. S’il y a trop de cellules, le comptage peut être plus difficile, ce qui entraîne des erreurs. En revanche, s’il y a trop peu de cellules, vous aurez plus d’erreurs aléatoires. La concentration cellulaire recommandée pour le comptage à l’aide d’un hémocytomètre est d’environ 106 cellules/ml. En utilisant une chambre de comptage Neubauer améliorée, la plage de concentration cellulaire optimale est de 2,5 × 105 à 2,5 × 106 cellules/ml2. Par conséquent, vous devrez peut-être diluer ou concentrer votre échantillon avant de procéder au comptage.
Si vous diluez vos cellules, notez votre facteur de dilution afin de pouvoir calculer ultérieurement la concentration de cellules dans l’échantillon d’origine. Le facteur de dilution peut être facilement calculé à l’aide de la formule suivante :
Facteur de dilution = Volume total de dilution (µl)/Volume de l’échantillon (µl)
Utilisation de votre hémocytomètre
En bref, la méthode de comptage des cellules par hémocytomètre comprend les étapes suivantes2:
- Nettoyez l’hémocytomètre et le couvercle en verre avec de l’éthanol. Assurez-vous que ce dernier s’évapore complètement pour qu’il n’affecte pas vos cellules.
- Fermez les chambres de l’hémocytomètre avec le couvercle pour empêcher votre échantillon de s’évaporer.
- À l’aide d’une micropipette, introduisez 10 µl de votre échantillon coloré dans l’une des chambres de comptage ou dans les deux. La capillarité assure une répartition uniforme de la suspension à l’intérieur de la chambre.
- Placez l’hématocytomètre sous l’objectif du microscope.
- Ajustez la mise au point jusqu’à ce que vous voyiez clairement les cellules présentes dans l’échantillon.
- Comptez les cellules à l’aide d’un compteur-enregistreur (voir ci-dessous pour plus de détails sur les règles de comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre). Conservez un suivi du nombre total de cellules et du nombre de cellules mortes.
- Une fois terminé, nettoyez l’hémocytomètre et le couvercle en verre avec de l’éthanol.
Règles de comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre
Les règles et stratégies de comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre peuvent varier d’une personne à l’autre et d’un laboratoire à l’autre. Avant de compter les cellules dans la grille d’hémocytomètre, vous devez décider dans quels carrés compter les cellules et quelles règles utiliser pour éviter de compter deux fois la même cellule. Rester cohérent avec la stratégie que vous avez choisie est essentiel pour obtenir des résultats précis et fiables, alors choisissez votre stratégie rigoureusement !
Quels carrés dois-je compter ?
Avant de procéder au comptage, vous devez décider dans quels carrés de la grille vous voulez compter. Il est crucial de choisir des carrés qui donnent une bonne représentation globale des cellules sur la lame. Évitez par exemple de compter uniquement les cellules dans les trois premiers carrés de la grille car cela pourrait ne pas être représentatif si le liquide ne s’est pas répandu uniformément sur toute la surface de la lame après avoir été introduit à l’aide de la pipette. Voici quelques stratégies courantes présentées par nos scientifiques internes :
En s’appuyant sur les expériences de notre équipe interne de scientifiques d’application sur le terrain, nous avons constaté que ces trois méthodes sont les plus utilisées :
La méthode logique de comptage
Une approche courante et représentative consiste à compter les cellules dans les quatre carrés situés dans les angles et celui du milieu de la grille de l’hémocytomètre. C’est ce que l’on appelle un « comptage logique ».
La numération absolue
L’alternative c’est de compter les cellules dans les neuf carrés de l’hémocytomètre. Cette méthode, connue sous le nom de « numération absolue », consiste à compter les cellules de tous les carrés en progressant en zig-zag. Cette méthode de comptage est avantageuse en cas de concentration élevée de cellules dans l’échantillon, car son schéma est facile à suivre, vous avez donc moins de risque de vous perdre et de devoir recommencer2.
La numération rapide
Enfin, si vous êtes pressé, vous pourriez être tenté d’effectuer la « numération rapide ». Cette méthode vous permet de compter uniquement les cellules de deux carrés opposés en diagonale. Avec cette approche, vos résultats ne seront pas aussi représentatifs qu’avec les autres méthodes, mais cela peut être un bon moyen de procéder à des vérifications ponctuelles de votre culture cellulaire si vous êtes pressé(e).
Quelles cellules se trouvent à l’intérieur du carré de comptage ?
Les règles permettant d’établir quelles sont les cellules qui sont comptées à l’intérieur d’un carré font en sorte que vous êtes sûr(e) que vous ne comptez pas deux fois la même cellule. Certains laboratoires incluent les cellules qui touchent les bordures supérieure et droite de la grille, en excluant celles qui touchent les bordures inférieure et gauche (voir schéma). D’autres laboratoires utilisent des règles différentes, alors, en cas de doute, demandez à vos collègues.
Quelle que soit la stratégie choisie, la chose la plus importante est la cohérence tout au long de votre procédure de comptage2, afin que vos résultats soient aussi précis que possible et que vous puissiez comparer vos données dans le temps.
Calcul de la concentration et de la viabilité des cellules à partir de vos résultats
Une fois que vous aurez compté vos cellules, vous pouvez utiliser votre nombre obtenu et le facteur de dilution pour déterminer le nombre total de cellules ou la concentration dans votre échantillon d’origine en appliquant la formule suivante :
Nombre total de cellules exprimé en nombre de cellules/ml = Nombre de cellules * facteur de dilution *104/Nombre de carrés comptés sur l’hémocytomètre
Chacun des neuf carrés de la grille de la chambre de comptage Neubauer améliorée a un volume de 0,1 mm3. Le facteur de multiplication de 104 dans la formule ci-dessus convertit le nombre de cellules par 0,1 mm3 en cellules par ml. La plupart des carrés d’hémocytomètre ont un volume de 0,1 mm3, donc, dans la plupart des cas, le facteur de multiplication sera de 104. Le tableau de gauche montre les facteurs de multiplication pour les autres chambres de comptage.
Lorsque vous comptez des cellules à l’aide d’un colorant cellulaire, vous pouvez également déterminer leur viabilité. Le suivi de la viabilité cellulaire peut faciliter la maintenance quotidienne de votre culture et vous aider à comprendre comment les cellules réagissent aux différents environnements3.
Une fois que vous connaissez le nombre total de cellules et celui des cellules mortes de votre échantillon, vous pouvez calculer la viabilité cellulaire en appliquant la formule suivante :
Viabilité cellulaire % = Cellules totales – cellules mortes/Cellules totales * 100
Erreurs dans le comptage cellulaire avec un hémocytomètre
Le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre est généralement sujet à des erreurs de 20 à 30 %2. Les sources d’erreur courantes vont de l’erreur humaine de procédure et calcul à des erreurs causées par une coloration cellulaire non-uniforme et des débris cellulaires.
Vous pouvez minimiser les erreurs en travaillant de la manière la plus cohérente et précise possible. Prenez soin de préparer correctement les dilutions, de pipeter soigneusement, d’établir des lignes directrices claires en matière de comptage et de faire preuve de diligence quant aux cellules que vous souhaitez compter. N’oubliez pas que la cohérence est reine ! Effectuer des comptages supplémentaires peut également garantir une fiabilité des résultats et vous aider à détecter les erreurs avant qu’il ne soit trop tard. En règle générale, nous répétons tous les comptages cellulaires trois fois, mais « en cas de doute, faites-en un autre ! »
Si vous souhaitez en savoir plus sur la minimisation des erreurs dans le comptage manuel de cellules, lisez le prochain article sur notre blog : « Révéler la précision de vos comptages manuels de cellules »
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Lectures complémentaires
- Journal: Le bleu de trypan est-il toxique ? Les dangers cachés d’un colorant très utilisé
- Journal: Réponses à toutes vos questions sur le comptage cellulaire
- Podcast: Standardisation du comptage cellulaire
- Journal: Pourquoi travailler avec du bleu de trypan n’est pas une bonne idée
- La gamme NucleoCounter®: Compteurs et analyseurs cellulaires automatisés
Référence
- Vembadi A, Menachery A, Qasaimeh MA.: Cell Cytometry: Review and Perspective on Biotechnological Advances. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:147.
- Electron Microscopy Sciences: Neubauer Haemocytometry.
- Stoddart MJ.: Cell viability assays: Introduction. Methods Mol Biol. 2011;740:1-6
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