Cellules sur microporteurs et cellules agrégées

Recherches en biologie cellulaire chez Hookipa Pharma

Le comptage des noyaux a été décrit pour la première fois par Sanford et al. en 1951 et modifié par van Wezel. Cette méthode consiste à perméabiliser les cellules par des solutions hypotoniques ; les noyaux sont colorés et comptés par un colorant, par exemple du cristal violet. Mais c’est un processus qui s’accompagne d’une surestimation des noyaux car on n’arrive pas à les distinguer avec précision des débris.

Pour surmonter ce problème, les cytomètres imageurs de ChemoMetec A/S fournissent une méthode rapide et fiable qui consiste à compter les noyaux à l’aide de fluorophores qui permettent de distinguer clairement les noyaux des débris cellulaires.

Détacher les cellules Vero des microporteurs

Les cellules Vero sont des cellules dépendantes de l’ancrage et peuvent être cultivées sur microporteurs afin d’augmenter la production et d’atteindre des rendements de plusieurs millions de cellules par millilitre dans des procédés de fermentation à grande échelle. Le suivi des cultures sur microporteurs est difficile et prend du temps car le processus de détachement se fait en plusieurs étapes.

Sur les microporteurs, les cellules Vero non-traitées apparaissaient comme une couche de cellules confluentes. Après deux minutes d’incubation, la couche cellulaire était déjà dissoute. Après une minute d’incubation, le réactif A100 ne parvenait pas à dissoudre tous les agrégats détectables dans les amas de cellules non-lysées entre les microporteurs agrégés restants.

Résultats

Les cellules HEK293 forment des agrégats cellulaires d’un diamètre atteignant jusqu’à 3 mm. Les algorithmes de nombreux compteurs cellulaires automatisés n’arrivent pas à déterminer le nombre exact de cellules à cause de l’aspect tridimensionnel qui est à l’origine de l’imprécision des résultats. La lyse par le Réactif A100 a contribue à une distribution uniforme des noyaux et l’algorithme était en mesure de distinguer et compter les noyaux uniques.

L’image A montre un diagramme de dispersion des données brutes de la zone relative au DAPI sur l’intensité de la coloration bleue des cellules à l’aide de la stratégie de déclenchement d’exclusion standard. Plusieurs images acquises (une affichée en B) ont été utilisées pour le comptage cellulaire. L’image C montre les noyaux individuels en détail ainsi que la superposition d’images pour mettre en évidence les cellules individuelles.

Visualiser l’ensemble de données dans l’affiche PDF

Résultats du comptage cellulaire à l’aide du NucleoCounter® NC-3000™ affichés dans le logiciel NucleoView™. Le diagramme de dispersion et les images montrent la distribution d’une population de cellules HEK293.

Conclusion

Le test A100 & B a été utilisé pour compter les cellules Vero cultivées sur microporteurs Cytodex 1. Après deux minutes d’incubation en présence du réactif A100, il était déjà possible de détecter le nombre maximum de noyaux cellulaires et le nombre total de cellules.

Nous avons en outre testé le même protocole pour les cellules HEK293 fortement agrégées. Le test A100 & B a pu dissoudre les agrégats HEK293 produisant suspension de cellules individuelles. Par rapport au comptage des cellules non-lysées, les noyaux cellulaires colorés ont formé une distribution uniforme qui a doublé la quantité de cellules totales comptées.

Pour nous à Hookipa, compter les noyaux à l’aide du NucleoCounter® NC-3000™ est un moyen précis et rapide de déterminer le nombre total et la viabilité des cellules HEK293 fortement agrégées et des cellules Vero sur microporteurs.

Auteurs

Philipp Andre et Andreas Aspöck.