En quoi utiliser du bleu de trypan est une mauvaise idée

Une revue sur la précision de la numération et de la viabilité cellulaire lors de l’utilisation du bleu de trypan

La toxicité du bleu de trypan impacte la précision des mesures de deux manières : (i) l’analyse de la viabilité change avec le temps, et (ii) la viabilité d’une population cellulaire est sous-estimée².

Des méthodes alternatives et plus précises existent

La microscopie à champ clair est utilisée pour valider et quantifier les cultures cellulaires. Cette méthodes donne des colorations ambiguës et se base sur une série de paramètres, tels que la rondeur et l’uniformité pour distinguer les cellules d’autres particules. Le bleu de trypan colore les cellules mortes dans des tons allant du bleu clair au noir selon la viabilité globale de la culture cellulaire. Lorsque la microscopie à champ clair est utilisée, les cellules très légèrement colorées au bleu de trypan peuvent être difficiles à différencier des cellules non colorées, et donc difficiles à identifier. À cela s’ajoute le fait que les membres individuels du laboratoire auront chacun une vision quelque peu subjective de ce qu’est une cellule morte et de ce qu’est une cellule vivante. Par conséquent, l’utilisation du bleu de trypan pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes introduit le risque de variabilité entre différents utilisateurs et instruments.

C’est pour cela que le dosage fluorimétrique est considéré comme une meilleure méthode d’évaluation de la viabilité cellulaire que le dosage colorimétrique tel que celui au bleu de trypan⁴. Les cellules ayant une quantité d’ADN/ARN relativement stable, l’acridine orange (AO) et le 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), qui sont des colorants fluorescents. Ces colorants interagissent avec l’ ADN produisant une coloration uniforme et permettant ainsi de quantifier les cellules alors que la méthode à champ clair produit une coloration non-spécifiée. L’AO est perméable à la membrane et colore la population cellulaire totale, tandis que le DAPI ne colore que la population de cellules mortes. Par conséquent, le dosage fluorimétrique de la viabilité cellulaire à l’AO et au DAPI garantit une précision supérieure dans l’identification des cellules vivantes et des cellules mortes avec un bruit et une variation réduits.

La sécurité est importante!

Garantir un environnement de travail sûr est essentiel pour les entreprises. Selon l’Agence européenne des produits chimiques (ECHA), le bleu de trypan peut provoquer un cancer, des anomalies génétiques et nuire à la fertilité ou nuire à la santé d’un enfant à naître⁵. Par conséquent, des précautions particulières doivent être prises pour éviter d’exposer les opérateurs au bleu trypan lors de l’utilisation et de l’élimination du colorant.

Un autre facteur important à prendre en compte lors de la manipulation du bleu de trypan est qu’il est classé comme cancérogène du groupe 2B (ECHA⁵ ). Cela rend le travail avec le bleu de trypan potentiellement dangereux pour les opérateurs du laboratoire puisque l’exposition doit être évitée lorsque cela est possible.
Il existe des alternatives de comptage cellulaire sûres qui offrent une précision accrue et une exactitude supérieure.

La Via2-Cassette ™ est un dispositif microfluidique unique qui fournit une précision et une exactitude inégalées du comptage cellulaire et élimine l’exposition de l’utilisateur aux produits chimiques. La Via2-Cassette ™ comprend une pipette intégrée qui prévient les erreurs lors du pipetage et de la coloration. Les colorants fluorescents AO et DAPI sont immobilisés à l’intérieur des canaux de la cassette, permettant ainsi la coloration automatique de la population cellulaire totale et celle des cellules mortes, respectivement. Tout au long du processus de comptage cellulaire, l’AO et le DAPI sont gardés à l’intérieur du dispositif microfluidique, ce qui réduit considérablement le risque d’exposition. La Via2-Cassette ™ est jetée après chaque utilisation, ce qui contribue à maintenir un environnement de travail sûr.

La Via2-Cassette ™ est utilisée avec le NucleoCounter NC-202 ™, un compteur automatique de cellules basé sur la fluorescence qui fournit une analyse de la totalité des cellules et des cellules vivantes, de la concentration en cellules mortes, de la viabilité et du DebrisIndex ™ d’un échantillon, le tout en environ 30 secondes. Les instruments sont fabriqués à partir de composants de haute qualité qui restent stables dans le temps. Cela, combiné à des procédures d’étalonnage approfondies effectuées au moment de la fabrication, détermine une faible variation entre les différents instruments, utilisateurs et sites. Cette technologie garantit un niveau de précision optimum de votre comptage cellulaire.

Le NucleoCounter NC-202 ™ avec la Via2-Cassette ™, associent une précision et une exactitude à l’avant-garde vous garantissant des résultats cohérents tout en protégeant les utilisateurs.

Références:

1. JR Tennant: Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation, 1964. 2: p. 685-94.
2. KT Tsaousis, N Kopsachilis, IT Tsinopoulos, SA Dimitrakos, FE Kruse, U Welge-Luessen: Time-dependent morphological alterations and viability of cultured human trabecular cells after exposure to Trypan blue. Clin Exp Ophthalmol, 2013. 41(5):484-90.
3. AKH Kwok, C-K Yeung, TYY Lai, K-P Chan, CP Pang: Effects of trypan blue on cell viability and gene expression in human retinal pigment epithelial cells. Br J Ophthalmol. 2004;88(12):1590-4.
4. SA Altman, L Randers, G Rao: Comparison of trypan blue dye exclusion and fluorometric assays for mammalian cell viability determinations. Biotechnol Prog. 1993;9(6):671-4.
5. European Chemical Agency (ECHA): Substance Infocard: Tetrasodium 3,3′-[(3,3′-dimethyl[1,1′-biphenyl]-4,4′-diyl)bis(azo)]bis[5-amino-4-hydroxynaphthalene-2,7-disulphonate]