R&D en biologie cellulaire

Figure 1. La Via1-Cassette™ est préchargée avec de l’Acridine Orange et du DAPI. La Via1-Cassette™ dont le volume est calibré au laser représente une solution tout-en-un pour optimiser le comptage cellulaire. Unité jetable en plastique, la cassette est préchargée avec les marqueurs fluorescents utilisés pour l’analyse. L’échantillon cellulaire est facilement aspiré dans la cassette en trempant la pipette intégrée dans la suspension cellulaire et en appuyant sur le piston.

Le comptage manuel à l’hématimètre avec mesure de la viabilité au bleu trypan est extrêmement chronophage et sujet à une variation très importante (intra- et inter-opérateur). Grâce au comptage et à la mesure de viabilité automatisée avec les NucleoCounter® NC-200™ et NC-3000™. , il suffit juste de charger la suspension dans la Via1-Cassette™ (Figure 1). Les cellules sont automatiquement marquées à l’acridine orange et au DAPI pour identifier respectivement la population cellulaire totale ainsi que les cellules mortes. Le volume de la chambre de mesure précalibré au laser assure à la fois une précision et une reproductibilité à ce jour inégalées. Grâce à la technologie sur laquelle reposent les NucleoCounter® NC-200™ et NC-3000™, il est possible d’analyser les résultats en cytométrie par imageur.

Lire la suite

Figure 2.Les lames A8-SlidesTM permettent de dénombrer (et de mesurer la viabilité) 8 échantillons en moins de 3 minutes. Il suffit juste de mélanger préalablement la suspension cellulaire à une solution contenant acridine orange et DAPI pour respectivement marquer la population cellulaire totale et les cellules mortes.

La lame 8 puits (A8-slide™) (Figure 2) permet de réaliser des comptages cellulaires(cellules de mammifères ou d’insectes) avec viabilité en haut débit puisqu’il vous est possible de faire 8 mesures en moins de 3 minutes. Il suffit uniquement de mélanger la suspension cellulaire avec une solution contenant le DAPI et l’acridine orange pour marquer respectivement les cellules mortes et les cellules totales. La lame A8-slide™ est ensuite insérée dans le NucleoCounter® NC-3000™. ChemoMetec A/S propose des protocoles optimisés pour compter les cellules agrégées, cultivées sur microporteurs ou en sphéroïdes.

Lire la suite

Figure 3. Inspection visuelle des cellules avec le logiciel Nucleoview™. Pour verifier et valider le comptage, les cellules apparaissant sur l’image peuvent être également identifiées sur le graphe et inversement.

Ainsi, tout comme avec le comptage manuel, il est possible de visualiser chacun des évènements dénombrés pour vérifier qu’il correspond à une cellule. Le logiciel NucleoView™ offre ainsi la possibilité de contrôler la pertinence du comptage. De façon analogue à la cytométrie, des populations spécifiques présentes sur le graphe peuvent être sélectionnés et donc examinées plus spécifiquement pour déterminer si elles doivent ou non être inclues dans le comptage à travers une analyse cartésienne du comptage à l’inverse d’un comptage manuel où les évènements sélectionnés sont sujets à la subjectivité de l’opérateur.

Lire la suite

Figure 4. Schéma du protocole “Viability and Cell Count – Aggregated Cells Assay”. Avec le test Aggregated Cells Assay du NucleoCounter®, même les cellules agrégées ou en amas peuvent être dénombrées. Dans ce protocole, le comptage de la population cellulaire totale est fait grâce à un aliquot de cet échantillon traité avec un tampon lysant spécifiquement les membranes plasmiques (voir schéma ci-dessus). Cette lyse des membranes plasmiques va permettre de suspendre les noyaux qui seront marqués en DAPI et donc comptés automatiquement. Parce que les cellules mortes sont moins abondantes et ont tendance à se détacher des agrégats, elles seront comptées directement à partir de l’échantillon non lysé (voir schéma ci-dessus). L’ensemble de ces 2 mesures permettra donc de déterminer avec une précision inégalable le nombre total de cellules et leur viabilité.

Lire la suite

Une analyse fine de la mort cellulaire nécessite de caractériser précisément le mécanisme de l’apoptose. Le NucleoCounter® NC-3000™ propose 5 tests clé-en-main pour mesurer les différentes phases de la mort cellulaire : l’Annexin V, le potentiel mitochondrial avec JC-1, la voie de signalisation des caspases, la fragmentation ADN et un test unique de 1-minute destiné à la mesure de la vitalité cellulaire (Tableau 1). Ces tests permettent de couvrir toutes les phases de l’apoptose pour un suivi précis de la mort cellulaire. Grâce à la simplicité du logiciel NucleoviewTM , n’importe quel utilisateur peut analyser les résultats en détail en cytométrie. L’instrument offre en outre la possibilité unique de relier les signaux sur les histogramme ou diagrammes de dispersion à ceux observés sur l’image en fluorescence afin d’obtenir les pourcentages de cellules vivantes, en apoptose ou en nécrose.

Pour suivre l’expression d’un gène d’intérêt transfecté dans la cellule, la méthode la plus couramment utilisée consiste à coexprimer une protéine fluorescente comme la GFP sous le même promoteur pour évaluer l’efficacité de la synthèse protéique. ChemoMetec A/S propose un test rapide, facile et sensible pour mesurer la production de GFP après transfection avec le NucleoCounter® NC-3000™ (Figure 4). Les cellules sont marquées à l’Hoechst 33342 et à l’iodure de propidium (PI) pour identifier respectivement la population cellulaire totale et les cellules mortes en parallèle à la mesure de la GFP. Après superposition des images obtenues, il est possible de générer des diagrammes de dispersions et histogrammes pour analyser la population en utilisant des gates comme en cytométrie (Figure 5). Le NucleoCounter® NC-3000™ est donc un appareil tout-en-un visant à évaluer l’expression de la GFP ainsi que la viabilité de la population cellulaire.

Figure 5. Principe du protocole clé-en-main “GFP transfection efficiency assay” sur le NucleoCounter® NC-3000™.

• (A) La population cellulaire est identifiée par un marquage à l’Hoechst 33342 (bleu) et le pourcentage de cellules exprimant la GFP (vert) peut être analysé avec plus de précision tandis que les cellules mortes sont marquées à l’iodure de propidium (rouge).
• (B) le marquage à l’Hoechst 33342 (bleu) permet au logiciel NucleoView™ d’identifier les cellules avec précision.
• (C) Les cellules exprimant la GFP apparaissent en vert et les cellules mortes (marquées au PI) apparaissent en rouge.

 

Figure 6. Connection entre l’acquisition en microscopie et le diagramme de dispersion permettant une inspection visuelle des populations « gatées ».

(A) Grâce à la superposition d’image automatisée faite par le logiciel NucleoView™, les cellules mortes (marquées au PI) peuvent être localisées (A) ainsi que les cellules transfectées avec la séquence codant la GFP (B) .

Lire la suite

Figure 7. Analyse rapide du cycle cellulaire

• (A) Les différentes phases du cycle peuvent être analysées à l’aide d’un marqueur fluorescent de l’ADN.
• (B) Test en 2 étapes du cycle cellulaire avec des cellules Jurkat traitées à la campthotécine (CPT). Les histogrammes représentent l’intensité du complexe ADN/DAPI et sont utilisés pour distinguer les différentes phases du cycle :sub-G1, G0/G1, S et G2/M. Le traitement à la CPT induit un blocage du cycle en G2/M.

L’impact d’un composé sur le cycle cellulaire représente un enjeu très important en biologie. Le NucleoCounter® NC-3000™ propose un test du cycle cellulaire rapide, simple et très sensible qui peut être effectué en moins de 5 min (Figure 7). Après addition d’un tampon de lyse spécifique de la membrane plasmique, tous les noyaux sont marqués avec un composé fluorescent et l’échantillon peut ainsi être analysé avec le NucleoCounter® pour quantifier le contenu ADN de chaque noyau. Un profil du cycle cellulaire de la population pourra être affiché dans le logiciel NucleoView™ et les évènements en phase sub-G1, G0/G1, S et G2/M seront identifiés. De plus, grâce au module FlexiCyte™, le NucleoCounter® NC-3000™ peut également être utilisé pour étudier la prolifération via l’incorporation de BrdU et de EdU.

Lire la suite

Figure 7. Sources d’excitation et filtres disponibles dans le module FlexiCyte™ du NucleoCounter® NC-3000™. Le module FlexiCyte permet de détecter en cytométrie SANS flux la plupart des fluorochromes utilisés en laboratoire.

Lire la suite