Test par coloration à l’aide de l’annexine V

Détection de l’apoptose à l’aide de l’annexine V et du NucleoCounter® NC-3000™

Vérifier si les cellules sont en apoptose/nécrose précoce ou tardive
Analyse rapide et automatisée des cellules individuelles
Résultats standardisés – même entre différents utilisateurs
Protocole facile à utiliser grâce à des paramètres prédéfinis
Aucun étalonnage requis
Présentation claire des données avec la fonctionnalité Plot Manager
Rapports automatisés au format PDF
Exportation des données aux formats FCS/ACS

Dans le test de coloration à l’annexine V, les cellules sont colorées à l’aide de l’annexine V, de la solution 15 et de la solution 16, puis elles sont chargées sur une lame de comptage cellulaire et ensuite comptées au moyen du NucleoCounter® NC-3000™.

Présentation du test par coloration à l’aide de l’annexine V

L’externalisation, ou translocation, de la phosphatidylsérine (PS) du feuillet de la membrane interne vers la membrane externe se produit au début du processus d’apoptose et précède d’autres événements apoptotiques tels que la perte d’intégrité de la membrane et la fragmentation de l’ADN.

Les annexines constituent un groupe de protéines cellulaires qui se lient aux phospholipides de manière dépendante du calcium. Un membre de ce groupe, l’annexine V, s’est révélé être un outil utile dans la détection des cellules apoptotiques car il présente une forte affinité pour la PS, et effectue donc sa translocation vers la membrane cellulaire externe en même temps qu’elle.

En utilisant l’annexine V marquée par fluorescence, on peut donc facilement détecter l’externalisation de la PS. L’annexine V peut également se lier à la PS sur les cellules apoptotiques et nécrotiques tardives, mais comme l’intégrité de la membrane sur ces cellules a été perdue, on peut les distinguer des cellules apoptotiques précoces en les colorant à l’iodure de propidium (IP). Comme le colorant IP n’est pas perméable à la membrane, on l’utilise pour colorer les cellules et l’ADN.

Principe du test

À l’aide de la microscopie à fluorescence et de l’analyse d’image, le cytomètre en images de pointe NucleoCounter® NC-3000™ détecte automatiquement les cellules apoptotiques sur la base de l’externalisation de la PS. Les cellules sont colorées à l’aide de Hoechst 33342, d’IP et d’annexine V marquée FITC.

Hoechst 33342 colore la population cellulaire totale, tandis que l’annexine V ne colore que les cellules apoptotiques et nécrotiques. Les cellules apoptotiques précoces excluent l’IP, tandis que les cellules apoptotiques et nécrotiques à un stade tardif se colorent positivement à l’annexine V et à l’IP.

Image des données du test à l’aide de l’annexine V où les cellules analysées sont affichées dans le logiciel NucleoView™.

Résultats présentés dans plot manager

Images des données traitées du test de coloration à l’aide de l’annexine V dans le logiciel NucleoView™ sous forme d'histogrammes et de nuages de points.

Le diagramme illustre l’effet de l’ajout de camptothécine (CPT) sur les cellules Jurkat. La CPT est un poison de la topoisomérase couramment utilisé, qui induit l’apoptose, induisant l’externalisation de la PS et permettant la liaison de l’annexine V. Les cellules Jurkat sont une lignée immortalisée de cellules lymphocytaires T humaines, auxquelles on a fréquemment recours pour étudier l’efficacité de potentiels composés anticancéreux.

Les cellules Jurkat ont été cultivées en l’absence (rangée supérieure) ou en présence (rangée inférieure) de camptothécine (CPT). Les cellules ont été colorées à l’aide de Hoechst 33342, d’annexine V-isothiocyanate de fluorescéine (FITC) conjugué à des anticorps et à de l’iodure de propidium (IP) et analysées en utilisant le test par coloration à l’aide de l’annexine V avec le NucleoCounter® NC-3000™.

Le logiciel NucleoView™ NC-3000™a fourni des diagrammes de dispersion et des histogrammes. L’utilisation de quadrants (B, F) et de marqueurs (C, D, G, H) dans les parcelles affichées a permis de délimiter les diverses populations cellulaires. Dans cet exemple, la CPT provoque une augmentation significative du nombre de cellules apoptotiques précoces (marquées comme des cellules positives à l’annexine V et négatives à l’IP dans le quadrant inférieur droit, F).